Modulación de los receptores con dominio Vps10p.

Un método in vitro para cribar un antagonista seleccionado de proteínas,

péptidos, polipéptidos,

anticuerpos, ARN de sentido contrario, ADN de sentido contrario, moléculas orgánicas pequeñas o ARNip, capaz de unirse a un receptor sortilina, que comprende las etapas de:

a) proporcionar un receptor sortilina, y

b) proporcionar ApoB como agonista,

c) proporcionar una biblioteca de potenciales antagonistas, y

d) proporcionar un ensayo para medir la unión de dicho agonista a dicho receptor, y

e) añadir la biblioteca de potenciales antagonistas que se van a ensayar al ensayo, y

f) determinar la cantidad de agonista unido a dicho receptor, y

g) comparar la cantidad determinada en la etapa f) con una cantidad medida en ausencia del antagonista que se va a ensayar,

h) en donde la diferencia en las dos cantidades identifica un antagonista que altera la unión de dicho agonista a dicho receptor.

Modulación de los receptores con dominio Vps10p

Campo de la invención La invención se refiere a la identificación de ligandos capaces de actuar como antagonistas/inhibidores de los receptores con dominio Vps10p.

Antecedentes de la invención La concentración plasmática de lipoproteínas de baja densidad (LDL) que transportan el colesterol en la circulación humana, es uno de los factores de riesgo más importantes de la morbilidad y mortalidad cardiovascular (1) . Las cantidades excesivas de colesterol en la circulación son depositadas en las paredes de los vasos coronarios produciendo el cierre del lumen del vaso y la obstrucción del flujo sanguíneo al corazón (y otros órganos.) Este proceso patológico se conoce como aterosclerosis. Como consecuencia de sucesos ateroescleróticos, se produce la arteriopatía coronaria y el infarto de miocardio. Dada la importancia de la gestión de los niveles de LDL en pacientes, el colesterol LDL sigue siendo hoy el objetivo principal de la terapia cardiovascular (2, 3) .

El riesgo de desarrollar enfermedades y afecciones como la ateroesclerosis, arteriopatía coronaria y cardiopatía coronaria se ha demostrado que está fuertemente correlacionado con los niveles altos de LDL-colesterol y triglicéridos. Los niveles elevados de lipoproteína de baja densidad-colesterol (LDL-colesterol) es un contribuyente asociado a lípidos significativo, por ejemplo, para la cardiopatía coronaria.

La ateroesclerosis y la arteriopatía coronaria asociada es la causa principal de la mortalidad en el mundo industrializado. A pesar de los intentos de modificar los factores de riesgo secundarios (fumar, obesidad, falta de ejercicio) y el tratamiento de la dislipidemia con la modificación de la dieta y la terapia con fármacos, la cardiopatía coronaria sigue siendo la causa más común de muerte en EE.UU., donde la enfermedad cardiovascular da cuenta de 44% de todas las muertes, con 53% de estas asociadas con cardiopatía coronaria aterosclerótica.

Se conoce una serie de rutas bioquímicas que afectan a los niveles plasmáticos de colesterol y se han considerado objetivos en la intervención terapéutica. Estas etapas incluyen la velocidad con la que es producido el colesterol en el organismo y es introducido en lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) , la extensión de la conversión de VLDL en LDL, así como la eficacia de la eliminación de las LDL en los tejidos hepáticos. Además, la conversión del colesterol en ácidos biliares que son secretados en el intestino afecta a los niveles de lípidos en la circulación.

La familia de receptores con dominio Vps10p

Los autores de la presente invención han estudiado el efecto de la modulación de la actividad de los receptores con dominio Vps10p en los niveles plasmáticos de LDL-colesterol y triglicéridos. Los miembros de esta familia de receptores son Sortilina, SorLA, SorCS1, SorCS2 y SorCS3.

Sortilina La sortilina, el miembro arquetípico de la familia de receptores con dominio Vps10p se denomina en ocasiones el receptor de neurotensina 3 (NTR3) , Glicoproteína 95 (Gp95) o receptor NT 100 kDa. La sortilina humana tiene número de acceso en Swiss Prot ID No. Q99523.

La sortilina, (SEQ ID NO. 1) es un receptor de membrana de tipo I expresado en una serie de tejidos, incluyendo el cerebro, médula espinal, testículos, hígado y músculo esquelético (6-7) . La sortilina pertenece a una familia de receptores que comprende Sortilina, SorLA (8) , SorCS1, SorCS2 y SorCS3.

Todos los receptores de esta familia comparten la característica estructural de un dominio N-terminal de aproximadamente 600 aminoácido con un gran parecido con cada uno de los dos dominios que constituyen la parte luminal del receptor de clasificación de levaduras Vps10p (9) . El dominio Vps10p (Vps10p-D) que entre otros ligandos une factores neurotróficos y neuropéptidos (10-14) , constituye la parte luminal entera de la sortilina (sSortilina) y es activado por la unión de ligando por escisión enzimática propeptídica (10, 11) . La sortilina es un receptor multifuncional de tipo 1 capaz de endocitosis así como de clasificación intracelular (9-11) , y como se ha mostrado recientemente, también está implicada en la señalización produciendo la inducción por proneurotrofina de la apoptosis neuronal mediada por p75NTR (12, 13, 18, 19) . La sortilina es sintetizada como una proproteína, que se convierte en la sortilina madura por escisión enzimática y eliminación de un propéotido N-terminal corto. Solo el receptor maduro se une a ligandos y lo que es interesante es que todos sus ligandos conocidos, por ejemplo, neurotensina (NT) , lipoproteína lipasa, las proformas del factor de crecimiento nervioso Ã? (proNGF) y factor neurotrófico derivado del cerebro (proBDNF) , proteína asociada al receptor (RAP) , y su propio péptido, compiten por la unión (11-13, 16) indicando que los diversos ligandos se dirigen a un sitio de unión compartido o parcialmente compartido. El NT es un tridecapéptido, que se une a sortilina, SortLA y los dos receptores acoplados a proteína G NTR1 y NTR2 (10, 20-22) . La función fisiológica de la NT en relación con la sortilina no se ha elucidado completamente (23) , aunque la NT es una herramienta importante, puesto que inhibe la unión de todos los demás

ligandos al Vps10p-D de la sortilina.

SorLA

El receptor relacionado con la proteína de clasificación, abreviada SorLA (nº de ID en Swiss Prot Q92673) , también conocida como LR11, es una proteína de membrana de tipo 1, de 250 kDa y el segundo miembro identificado en la familia de receptores con dominio Vps10p de SorLa, como la sortilina, cuyo dominio lumenal consiste en un dominio Vps10p solo, se sintetiza como un pro-receptor que es escindido por furina en los compartimentos tardíos de Golgi. Se ha demostrado que el truncado acondiciona el dominio Vps10p para la unión inhibidora al propéptido de neuropéptidos y la proteína asociada al receptor. Se ha demostrado (21) que se produce la unión ávida de la proteína asociada al receptor, apolipoproteína E, y la lipoproteína lipasa no inhibida por propéptido en sitios localizados en otros dominios lumenales. En células transfectadas, aproximadamente 10% de SorLa de longitud completa es expresada en la superficie celular capaz de mediar la endocitosis. El principal grupo de receptores se encuentra en los compartimentos tardíos de Golgi, y se ha sugerido la interacción con ligandos recién sintetizados.

SorCS1-3

SorCS1 (nº de ID en Swiss Prot Q8WY21) , SorCS2 (nº de ID en Swiss Prot Q96PQ0) y SorCS3 (nº de ID en Swiss Prot Q9UPU3) constituyen un subgrupo de proteínas muy similares mutuamente que contienen tanto un Vps10p-D como un dominio rico en leucina limitando el dominio transmembrama (14, 26) . SorCS1 puede tener una función importante fuera del sistema nervioso, ya que su región en el gen se ha identificado como un locus de característica cuantitativa de la diabetes de tipo 2 en ratones (27) , y las variaciones en el gen de SorCS1 humano se asocian con características relacionadas con la diabetes (28) . Se presentan indicaciones adicionales en esta dirección en otro estudio (29) en donde la SorCS1 se asocia con la región Niddm1i 16-Mb controladora de glucosa principal, en la rata GK diabética, una región que produce secreción defectuosa de insulina y que también corresponde a los locus en seres humanos y ratones asociados con la diabetes de tipo 2.

Estado de la técnica El estado actual de la técnica para la terapia de LDL plasmático alto es la aplicación de estatinas, inhibidores que interfieren con la producción de colesterol endógeno y por lo tanto, reducen la producción de partículas LDL ricas en colesterol. Sin embargo, el uso de estatinas está asociado con un riesgo sustancial de efectos secundarios tales como efectos adversos en las funciones muscular y hepática, así como en las capacidades cognitivas (4, 5) . Por lo tanto, los amplios esfuerzos de investigación se dirigen a la identificación de nuevos factores que contribuyen a la regulación del metabolismo del colesterol plasmático. Estos factores pueden representar alternativas más seguras a la intervención terapéutica con altos niveles de LDL plasmático.

Recientemente, una serie de grupos ha usado estudios de asociación del genoma completo para identificar regiones cromosómicas en el genoma humano que se puedan asociar con el control de los valores de lípidos plasmáticos. En particular, estos estudios sugieren simplemente determinadas regiones en cromosomas particulares que pueden tener algún valor predictivo de las concentraciones de lípidos y riesgo cardiovascular. Ninguno de estos estudios proporciona pruebas experimentales que confirmen una función... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para cribar un antagonista seleccionado de proteínas, péptidos, polipéptidos, anticuerpos, ARN de sentido contrario, ADN de sentido contrario, moléculas orgánicas pequeñas o ARNip, capaz de unirse a un receptor sortilina, que comprende las etapas de:

a) proporcionar un receptor sortilina, y b) proporcionar ApoB como agonista, c) proporcionar una biblioteca de potenciales antagonistas, y d) proporcionar un ensayo para medir la unión de dicho agonista a dicho receptor, y e) añadir la biblioteca de potenciales antagonistas que se van a ensayar al ensayo, y f) determinar la cantidad de agonista unido a dicho receptor, y g) comparar la cantidad determinada en la etapa f) con una cantidad medida en ausencia del antagonista que se va

a ensayar,

h) en donde la diferencia en las dos cantidades identifica un antagonista que altera la unión de dicho agonista a dicho receptor. 2. Un método para determinar el grado de inhibición de un antagonista, seleccionado de proteínas, péptidos,

polipéptidos, anticuerpos, ARN de sentido contrario, ADN de sentido contrario, moléculas orgánicas pequeñas o ARNip, en la actividad de un receptor sortilina en un cultivo celular que expresa dicho receptor, en donde dicho receptor sortilina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 60% con la SEQ ID NO: 1, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) proporcionar un cultivo celular que expresa dicho receptor sortilina, y b) proporcionar ApoB como agonista de dicho receptor sortilina, y c) proporcionar una biblioteca de potenciales antagonistas, y d) proporcionar un ensayo para determinar la unión a, internalización de y señalización a través de, dicho receptor

sortilina, comprendiendo dicho ensayo,

e) añadir la biblioteca de potenciales antagonistas que se van a ensayar c) al cultivo celular a) , en presencia de dicho agonista b) , y f) determinar

i) la cantidad de antagonista unido a dicho receptor sortilina, y/o ii) la cantidad de antagonista internalizado por dicho receptor sortilina, y/o iii) el grado de señalización a través de dicho receptor sortilina, y

g) comparar la cantidad determinada en la etapa f) con una cantidad medida en ausencia del antagonista que se va a ensayar, h) en donde la diferencia en las dos cantidades identifica un antagonista i) capaz de unirse a dicho receptor sortilina, y/o ii) capaz de inhibir la señalización a través de dicho receptor sortilina, y/o iii) capaz de inhibir la internalización de dicho agonista de dicho receptor sortilina.

3. Un método para determinar el grado de inhibición de un antagonista seleccionado de proteínas, péptidos, polipéptidos, anticuerpos, ARN de sentido contrario, ADN de sentido contrario, moléculas orgánicas pequeñas o ARNip, en la actividad de un receptor sortilina en un cultivo celular que expresa dicho receptor y con un cultivo celular que carece de expresión de dicho receptor, comprendiendo el método las etapas de:

a) proporcionar un cultivo celular que expresa un receptor sortilina, y b) proporcionar un cultivo celular que no expresa un receptor sortilina, y c) opcionalmente proporcionar un cultivo celular que expresa en exceso un receptor sortilina d) proporcionar ApoB como agonista del receptor sortilina, y e) proporcionar una biblioteca de potenciales antagonistas, y f) proporcionar un primer ensayo que comprende a) y un segundo ensayo que comprende b) y opcionalmente un tercer ensayo que comprende c) , y g) añadir la biblioteca de potenciales antagonistas que se van a ensayar a los tres ensayos, y h) determinar

i) la cantidad de antagonista unido al receptor sortilina, y/o ii) la cantidad de antagonista internalizado por el receptor sortilina, y/o iii) el grado de señalización a través del receptor sortilina, y

i) comparar la cantidad de antagonista determinada en la etapa g) usando a) con la cantidad determinada en g) usando b) y la cantidad determinada en g) usando c) , j) en donde la diferencia en las cantidades identifica un antagonista i) capaz de unirse a un receptor sortilina, y/o ii) capaz de inhibir la señalización a través de un receptor sortilina, y/o iii) capaz de inhibir la internalización de ApoB como agonista de dicho receptor sortilina.

4. Un método para determinar el grado de inhibición de un antagonista seleccionado de proteínas, péptidos, polipéptidos, anticuerpos, ARN de sentido contrario, ADN de sentido contrario, moléculas orgánicas pequeñas o ARNip, en la actividad de un receptor sortilina en un mamífero no humano que expresa dicho receptor, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) administrar dicho antagonista a un mamífero no humano que expresa el receptor de forma natural,

b) determinar i) la cantidad de antagonista unido a dicho receptor sortilina, y/o ii) la cantidad de antagonista internalizado por dicho receptor sortilina, y/o iii) el grado de señalización a través de dicho receptor sortilina, y

c) comparar la medición de la etapa b) con una medición obtenida en ausencia del compuesto que se va a ensayar,

d) en donde la diferencia en las dos cantidades identifica el efecto de dicho antagonista en dicho mamífero no humano que expresa el receptor de forma natural. 5. Un método para determinar el grado de inhibición de un antagonista seleccionado de proteínas, péptidos,

polipéptidos, anticuerpos, ARN de sentido contrario, ADN de sentido contrario, moléculas orgánicas pequeñas o ARNip, en la actividad de un receptor sortilina en un mamífero no humano que expresa dicho receptor con un segundo mamífero no humano que carece de expresión de dicho receptor y un tercer mamífero no humano que expresa en exceso dicho receptor, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) proporcionar un mamífero no humano que expresa dicho receptor sortilina, y b) proporcionar un mamífero no humano que no expresa dicho receptor sortilina, y c) proporcionar un mamífero no humano que expresa en exceso dicho receptor sortilina, y d) proporcionar ApoB como agonista de dicho receptor sortilina, y e) proporcionar una biblioteca de potenciales antagonistas, y f) administrar dicha biblioteca de antagonistas a dicho mamífero no humano de a) , b) y c) respectivamente, y g) determinar

i) la cantidad de antagonista unido a dicho receptor sortilina, y/o ii) la cantidad de antagonista internalizado por dicho receptor sortilina, y/o

iii) el grado de señalización a través del receptor sortilina, en cada uno de los mamíferos no humanos en a) ,

b) y c) , y h) comparar la cantidad de antagonista determinada en la etapa g) usando a) con la cantidad determinada en g) usando b) y la cantidad determinada en g) usando c) ,

i) en donde la diferencia en las cantidades identifica un antagonista i) capaz de unirse a dicho receptor sortilina, y/o ii) capaz de inhibir la señalización a través de dicho receptor sortilina, y/o iii) capaz de inhibir la internalización de dicho agonista de ApoB de dicho receptor sortilina.

6. El método según las reivindicaciones 1-5, en donde dicho antagonista es un anticuerpo seleccionado del grupo 10 que consiste en: anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos de una cadena, anticuerpos recombinantes. 7. El método según las reivindicaciones 1-6, en donde dicho antagonista es un anticuerpo dirigido contra la parte extracelular de la sortilina.