Métodos y composiciones para el marcado de proteínas.

Un método de marcado de una proteína que comprende hacer reaccionar un reactivo de marcado seleccionado de:

**Fórmula**

en el que n y m están seleccionados independientemente de un número entero de 2 a 12; y una proteína seleccionada de un anticuerpo, un interferón, una linfocina, una citocina, una hormona o un factor de crecimiento, por lo cual se forma una proteína marcada.

Métodos y composiciones para el marcado de proteínas Campo de la invención

La invención se refiere generalmente a métodos para conjugar o marcar grupos a proteínas. La invención también se refiere a proteínas marcadas, y a productos intermedios y reactivos útiles para preparar proteínas marcadas para investigación y desarrollo clínico de novedosas pruebas terapéuticas y de diagnóstico.

Antecedentes de la invención

Las proteínas y péptidos constituyen una gran parte del armamento disponible para la obtención de imágenes moleculares de biomarcadores de la superficie celular. Las proteínas elegidas como diana producidas por ingeniería genética son muy atractivas como agentes de obtención de imágenes por TEP, pero el marcado con grupos prostéticos basados en 18F convencionales es problemático debido a los largos tiempos de síntesis, malos rendimientos radioquímicos y baja actividad específica. Aunque el desarrollo de agentes de obtención de imágenes "ideales" es un objetivo importante, en la práctica se desarrollan muchos agentes de obtención de imágenes a partir de proteínas existentes, tales como anticuerpos monoclonales (mAb) y sus fragmentos manipulados, que se desarrollan inicialmente como posibles agentes terapéuticos o para explorar una biología diana. Los agentes de obtención de imágenes por TEP pueden funcionar en ensayos de diagnóstico o pruebas de biomarcadores, para permitir la selección de pacientes, informar de decisiones sobre la elección de la indicación para candidatos terapéuticos y maximizar el beneficio clínico de un agente terapéutico que dirige el mismo receptor o vía de enfermedad vía. Se realizan pruebas de biomarcadores predictivas antes del tratamiento para predecir si es probable que un tratamiento particular sea beneficioso. Los biomarcadores de pronóstico se correlacionan con el desenlace de la enfermedad y pueden mejorar el diseño del ensayo clínico y el tratamiento, y los niveles de confianza de interpretación de datos.

El desarrollo de agentes de obtención de imágenes para tomografía por emisión de protones (TEP) a partir de un molde de mAb (Immuno-PET) es muy prometedor como herramienta para localizar y cuantificar dianas moleculares y puede potenciar el diagnóstico clínico no invasivo de afecciones patológicas (van Dongen et al (2007) Oncologist 12; 1379-89; Williams et a (2001) Cáncer Biother Radiopharm 16:25-35; Holliger et al (2005) Nat Biotechnol 23:1126- 36). La TEP es una tecnología de obtención de imágenes moleculares que cada vez se usa más para la detección de enfermedad. Los sistemas de obtención de imágenes de TEP crean imágenes basándose en la distribución de isótopos emisores de positrones en el tejido de un paciente. Los isótopos normalmente se administran a un paciente mediante inyección de moléculas de sonda que comprenden un isótopo emisor de positrones, tal como F-18, C-11, N-13 o 0-15, covalentemente unido a una molécula que es fácilmente metabolizada o se localiza en el cuerpo (por ejemplo, glucosa) o que se une químicamente a sitios receptores dentro del cuerpo. En algunos casos, el isótopo se administra al paciente como una solución iónica o por inhalación. Agentes de obtención de imágenes de Immuno- PET pequeños, tales como fragmentos de anticuerpos Fab (50 kDa) o diacuerpos, dímeros emparejados de la región Vh-Vl covalentemente asociada del mAb, 55 kDa (Shively et al (2007) J Nucí Med 48:170-2), pueden ser particularmente útiles ya que presentan una semivida en la circulación corta, alta permeabilidad de tejidos y alcanzan una relación óptima de tumor con respecto a fondo entre dos a cuatro horas después de la inyección, facilitando el uso de isótopos de semivida corta tales como el 18F ampliamente disponible (109,8 min).

Las proteínas elegidas como diana producidas por ingeniería genética son muy atractivas como agentes de obtención de imágenes de TEP, pero el marcado con grupos protésicos basados en 18F convencionales es problemático debido a largos tiempos de síntesis, malos rendimientos radioquímicos y baja actividad específica, una plataforma modular para la rápida preparación de diversos grupos protésicos solubles en agua capaz de introducir eficazmente 18F en proteínas. La combinación de la sensibilidad y alta resolución ofrecida por la obtención de imágenes de TEP basada en 18F con la alta especificidad de estos fragmentos de anticuerpos es una estrategia particularmente atractiva para la investigación y el desarrollo clínico de novedosos ensayos de diagnóstico y terapéuticos. La producción de proteínas marcadas con 18F por los actuales métodos es inadecuada debido a que son necesarias condiciones de reacción acuosas relativamente suaves para preservar la función de la mayoría de las proteínas. Los grupos prostéticos marcados con 18F existentes usados para las conjugaciones de proteína están frecuentemente limitados por alguna combinación de mal rendimiento radioquímico, largo tiempo de síntesis y baja actividad específica. Los métodos mejorados para generar proteínas marcadas con 18F son valiosos en facilitar la obtención de imágenes moleculares en seres humanos para tratar procesos de desarrollo clínico tales como el nivel de expresión diana, heterogeneidad y transcurso de la expresión.

Se prefiere la conjugación específica de sitio con respecto a la modificación del amino aleatoria ya que permite la modificación química de un sitio lejos del sitio de unión, promoviendo la completa retención de la actividad biológica y permitiendo el control con respecto al posible número de grupos prostéticos añadidos. Se han investigado las proteínas genéticamente manipuladas que contienen cisteína en posiciones seleccionadas para desarrollar conjugaciones específicas de sitio (Junutula, J.R. et al (2008) J Immunol Methods 332:41-52; documento US 2007/0092940). El marcado de radionúclidos de grupos tiol sobre residuos de cisteína manipulados por grupos

prostéticos es ventajoso como método específico de sitio ya que la presencia de cisterna está limitada dentro del proteoma, del cual la forma de disulfuro no reactiva es la dominante (Olafsen et al (2004) Protein Eng Des Sel 17:21- 7; Tait et al (2006) J Nucí Med 47:1546-53; Li et al (2008) Bioconjug Chem 19:1684-8). Un método de manipulación de proteínas, PHESELECTOR, emplea biblioteca de expresión en fago para seleccionar la posición de aminoácido óptima para la sustitución de cisterna (Junutula et al. (2008) Nat Biotechnol 26:925-32; Junutula et al (2008) J Immunol Methods 332:41-52; documento US 2007/0092940). Usando el método PHESELECTOR se retiene la estabilidad y afinidad de unión de proteínas, mientras que se minimiza la formación de enlaces disulfuro no deseados, proporcionando eficiencias de conjugación óptimas. Este método se usa para producir mAb modificado que contiene una cisterna disponible (TiomAb), a partir del cual se genera convenientemente un fragmento Fab (TioFab) con un grupo tiol reactivo.

Se han usado grupos prostéticos que contienen el grupo maleimida, tales como [18F]FBEM (Caí et al (2006) J Nucí Med 47:1172-80), [18F]FBAM (Berndt et al (2007) Nucí Med Biol 34:5-15), [18F]FBABM (L¡ et al (2008) Bioconjug Chem 19:1684-8; Toyokuni et al (2003) Bioconjug Chem 14:1253-9), [18F]FBOM (Wuest et al (2009) Amino Acids 36:283-295), [18F]FDG-MHO (Wuest et al (2008) Bioconjug Chem 19:1202-10) y [18F]FPyMe (de Bruin et al (2005) Bioconjug Chem 16:406-20) para introducir de forma específicamente de sitio 18F en una proteína que lleva tiol. Estos reactivos de marcado [18F]FBEM, [18F]FBAM, [18F]FBABM y [18F]FBOM se desarrollaron a partir de una plataforma común en la que el precursor aromático, 18F-fluorobenzaldehído ([18F]FBALD), se acopla a un precursor de maleimida que lleva aminooxi. Sin embargo, la presencia de restos aromáticos y alifáticos (con la excepción de [18F]FBOM) potencia la lipofilia de estos grupos prostéticos, limitando posiblemente la eficiencia de conjugación con grupos de tiol de la proteína presentes dentro de un entorno hidrófilo. Además, estos grupos prostéticos requieren largos tiempos de síntesis y normalmente proporcionan rendimientos radioquímicos relativamente malos de proteína marcada con 18F. El documento US 2008/0161537 describe un método en el que se usan grupos maleimida para unir un grupo azida o alquino a una proteína que lleva tiol, seguido de marcado usando alquino/azida marcada con

18p

Sumario

Se proporciona una plataforma modular para la rápida preparación de diversos grupos prostéticos solubles en agua capaces de introducir eficazmente 18F en proteínas.

Un aspecto de la invención incluye métodos de marcado de una proteína que comprenden hacer reaccionar un reactivo de marcado y una... [Seguir leyendo]

1. Un método de marcado de una proteína que comprende hacer reaccionar un reactivo de marcado seleccionado de:

en el que n y m están seleccionados independientemente de un número entero de 2 a 12; y una proteína seleccionada de un anticuerpo, un interferón, una linfocina, una atocina, una hormona o un factor de crecimiento, por lo cual se forma una proteína marcada.

2. El método de marcado de una proteína de la reivindicación 1, en el que el reactivo de marcado es:

.O

/

NJ

6 N=N 7

o:

Br

V

N=N 7

F

o:

H

Proteína----N

N=N

3. El método de marcado de una proteína de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que la proteína comprende un tiol de cisteína libre.

4. El método de marcado de una proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el tiol de cisteína libre de la proteína reacciona con el reactivo de marcado.

Proteína-

m N=N

iaF

n

Proteína

F

Proteína NH

o*i^ohf>^40-'';kF

m N=N

5 que comprende hacer reaccionar un reactivo de alquino seleccionado de:

n

//

O'

O

m

"WtX 0

con una proteína seleccionada de un anticuerpo, un ¡nterferón, una linfocina, una atocina, una hormona o un factor 10 de crecimiento, para formar una alquino-proteína seleccionada de:

H

Proteína[\l

yT^

m

y hacer reaccionar la alquino-proteína con un reactivo de 18F-PEG-azida que tiene la fórmula:

N

n18F

20 en presencia de un catalizador de cobre,

en la que n y m están seleccionados independientemente de un número entero de 2 a 12; por lo que se forma la proteína marcada.

O

que comprende hacer reaccionar un reactivo de azida seleccionado de:

con una proteína seleccionada de un anticuerpo, un interferón, una linfocina, una atocina, una hormona o un factor de crecimiento, para formar una azido-proteína seleccionada de:

H

Proteína----N

O

y hacer reaccionar la azido-proteína con un reactivo de 18F-PEG-alqu¡no que tiene la fórmula:

n

en presencia de un catalizador de cobre,

en las que n y m están seleccionados Independientemente de un número entero de 2 a 12; por lo que se forma la proteína marcada.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteína es un anticuerpo seleccionado de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo murino, un anticuerpo

quimérico, un anticuerpo humano y un anticuerpo humanizado.

8. El método de la reivindicación 7, en el que el anticuerpo es un fragmento Fab.

9. El método de la reivindicación 8, en el que el fragmento Fab es 4D5TioFab.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el catalizador de cobre es Cu(MeCN)4PFeo CuSCU.

11. Un reactivo de marcado seleccionado de:

en las que n y m están seleccionados independientemente de un número entero de 2 a 12.

12. El reactivo de marcado de la reivindicación 11 que tiene la fórmula:

F

o:

Br

V

N~N 7 h

o

V

N=N 7 F

N=N

Proteína¡vj||

m N=Ñ " F

ProteínaS'

O

O

m

N=N

F

n

Proteína

O

Os

F

n

Proteína

H

N

F

n

en las que n y m están seleccionados Independientemente de un número entero de 2 a 12; y la proteína está 10 seleccionada de un anticuerpo, un interferón, una línfoclna, una atocina, una hormona y un factor de crecimiento.

14. Una composición farmacéutica que comprende una proteína marcada y uno o más vehículos, deslizantes, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables, en la que la proteína marcada está seleccionada de

en las que n y m están seleccionados independientemente de un número entero de 2 a 12; y la proteína está seleccionada de un anticuerpo, un interferón, una linfocina, una citocina, una hormona y un factor de crecimiento.

15. Un método de obtención de imágenes que comprende: administrar la proteína marcada a un animal; y

detectar in vivo la presencia de la proteína marcada por obtención de imágenes, en el que la proteína marcada está seleccionada de:

Proteína-

en las que n y m están seleccionados Independientemente de un número entero de 2 a 12; y la proteína está seleccionada de un anticuerpo, un interferón, una linfocina, una citocina, una hormona y un factor de crecimiento.

16. El método de la reivindicación 15, en el que la proteína marcada se une al antígeno y/o el animal es un modelo de ratón de xenoinjerto de tumor.

17. Un proceso de preparación de un reactivo de marcado que tiene la fórmula:

N n

en la que:

n y m están seleccionados independientemente de un número entero de 2 a 12.

que comprende hacer reaccionar un reactivo de maleimida-PEG-alqumo que tiene la fórmula:

O

con un reactivo de 18F-PEG-azida que tiene la fórmula:

N

n

F

en presencia de un catalizador de cobre,

en la que n y m están seleccionados independientemente de un número entero de 2 a 12, por lo que se forma el reactivo de marcado.