Métodos y composiciones con actividad terapéutica mejorada.

Un método in vitro para controlar las propiedades de una molécula que contiene Fc,

que comprende alterar la sialilación de los oligosacáridos en la región Fc en la glicoforma sialilada G2S2, en el que la sialilación aumenta en la región Fc, en el que la sialilación se altera de la región Fc no mutante por tratamiento enzimático o modificación enzimática de la molécula por una a-(2,3)-sialiltransferasa, y en el que las propiedades controladas están seleccionadas del grupo que consiste en afinidad por uno o más de los receptores FcgRI, FcgRIIA y FcgRIIIA, actividad de ADCC, activación de macrófagos o monocitos, semivida en suero y avidez.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo La divulgación se refiere a métodos de modificación de proteínas terapéuticas que interaccionan con receptores de Fc y que producen proteínas terapéuticas modificadas, por ejemplo, anticuerpos, de forma que la composición de las cadenas de oligosacárido pueda mejorar la avidez del anticuerpo por su diana y altera la afinidad de unión del receptor y, por tanto, la actividad de función efectora de dichos anticuerpos en comparación con anticuerpos sin modificar.

Descripción de la técnica relacionada Los anticuerpos son glicoproteínas del suero solubles que desempeñan una función significativa en la inmunidad innata. Las estructuras de hidrato de carbono de todos los anticuerpos naturalmente producidos en posiciones conservadas en las regiones constantes de la cadena pesada varían con el isotipo. Cada isotipo posee una matriz distinta de estructuras de oligosacárido ligadas en N, que afectan variablemente el ensamblaje de proteínas, secreción o actividad funcional (Wright, A., y Morrison, S. L., Trends Biotech. 15:26-32 (1997) ) . Con referencia a las Fig. 1 y 2, la estructura de los oligosacáridos ligados en N unidos varía considerablemente, dependiendo del grado de procesamiento, y puede incluir alta manosa, además de oligosacáridos biantenarios complejos con o sin GlcNAc bisecante y residuos de fucosa central (Wright, A., y Morrison, S. L., arriba) . Normalmente, hay procesamiento heterogéneo de las estructuras de oligosacárido centrales unidas en un sitio de glicosilación particular, de forma que incluso anticuerpos monoclonales existen como múltiples glicoformas. Asimismo, se ha mostrado que se producen diferencias importantes en la glicosilación de anticuerpos entre líneas celulares productoras de anticuerpos, e incluso se observan diferencias menores para una línea celular cultivada bajo diferentes condiciones de cultivo.

El ácido siálico sobre glicanos (grupos estáticos) es conocido por ser importante en prolongar la semivida en suero de glicoproteínas distintas de anticuerpos (Stockert, R. J. (1995) Physiol. Rev. 75, 591-609) . Hasta la fecha, la función del ácido siálico sobre anticuerpos monoclonales (mAb) no era bien entendida. La semivida en suero de los mAb es particularmente de larga duración y la construcción de proteínas de fusión de Fc ha demostrado ser una estrategia útil en el desarrollo de proteínas terapéuticas, por ejemplo, la proteína enteracept.

Los anticuerpos y moléculas receptoras de linfocitos T poseen regiones que son responsables de la unión de receptores de la superficie celular específicos, unión que modula la respuesta celular. En el sistema inmunitario, estas funciones se clasifican como humorales y celulares. Los anticuerpos se denominan frecuentemente moléculas adaptadoras que enlazan mecanismos inmunitarios humorales y celulares: respuestas humorales que se atribuyen principalmente a anticuerpos circulantes secretados maduros capaces de alta unión por afinidad a un antígeno diana. Las respuestas celulares se atribuyen a las consecuencias de la activación celular por la unión de complejos de ab-ag y por secuelas en la dirección 3’ producidas por la liberación de mediadores celulares como resultado de la unión del complejo de ab-ag a células efectoras. Estas respuestas celulares incluyen neutralización de diana, opsonización y sensibilización (si el antígeno se expresa sobre la superficie de una célula) , sensibilización de mastocitos y activación del complemento. Para dianas celulares, es decir, antígenos de superficie celular, estas funciones efectoras conducen a lo que comúnmente se conoce como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) .

Entre los isotipos de anticuerpos (por ejemplo, IgE, IgD, IgA, IgM e IgG) , las IgG son las más abundantes, presentando las subclases de IgG1 el grado más significativo y matriz de funciones efectoras. Los anticuerpos de tipo IgG1 son los anticuerpos más comúnmente usados en la inmunoterapia del cáncer en la que la actividad de ADCC y CDC se consideran frecuentemente importantes. Estructuralmente, la región bisagra y los dominios CH2 de IgG desempeñan una función importante en las funciones efectoras del anticuerpo. Los oligosacáridos ligados en N presentes en la región Fc (formados por la dimerización de la bisagra, dominios CH2 y CH3) afectan las funciones efectoras. Los oligosacáridos covalentemente unidos son estructuras de tipo biantenarias complejas y son altamente heterogéneas (véanse las Figs. 1 y 2) . Un sitio de glicosilación ligado en N conservado en Asn297 se encuentra en cada dominio CH2. En el anticuerpo maduro, los dos oligosacáridos biantenarios complejos unidos en Asn297 están enterrados entre los dominios CH2, formando amplios contactos con el esqueleto del polipéptido. Se ha encontrado que su presencia es esencial para que el anticuerpo medie en funciones efectoras, tales como ADCC (Lifely, M. R., et al., Glycobiology 5:813-822 (1995) ; Jefferis, R., et al., Immunol Rev. 163:59-76 (1998) ; Wright, A. y Morrison, S. L., arriba) .

Estos oligosacáridos heterogéneos contienen predominantemente residuos de ácido siálico, fucosa, galactosa y GlcNAc como azúcares terminales (Raju, T.S., et al., Glycobiology 2000. 10 (5) : 477-86) . Se ha mostrado que algunos de estos azúcares terminales, tales como los residuos de galactosa expuesta, fucosa de núcleo y GlcNAc bisecante, afectan la actividad de ADCC, actividad de CDC, y también afectan la unión del anticuerpo a diversos

ligandos que incluyen la proteína del complemento C1q (Presta L. 2003. Curr Opin Struct Biol. 13 (4) :519-25) . Aunque la mayoría de los oligosacáridos ligados en N que están presentes en Fc son de naturaleza biantenaria compleja, no están sialilados a un grado significativo (Idusogie EE, et al., 2000. J Immunol. 15:164 (8) :4178-84) .

Las principales estructuras encontradas en la IgG humana y otras IgG recombinantemente producidas son las estructuras biantenarias complejas con o sin residuos de Gal expuestos (Fig. 1) . Se ha estudiado en detalle la significancia biológica de las estructuras que contienen Gal terminal sobre las funciones del anticuerpo. El grado de galactosilación de los anticuerpos está afectado por la edad, sexo y enfermedad (Raju, T.S., et al., Glycobiology 2000. 10 (5) : 477-86) . En general, las estructuras de los oligosacáridos son algo específicas de especie y varían ampliamente. Además, también se ha estudiado la significancia biológica de las estructuras de oligosacáridos con y sin residuos de GlcNAc bisecante y de fucosa de núcleo. La IgG humana y muchas de las IgG recombinantemente producidas contienen cantidades menores de oligosacáridos sialilados, sin embargo, la gran mayoría de las IgG contienen estructuras de oligosacárido no sialilado.

La información sobre los efectos del ácido siálico en el glicano de Fc de Ab sobre la función de Fc ha sido limitada, debido parcialmente a la falta de disponibilidad de pares de los mismos mAb de base que se diferencian significativamente en el contenido de ácido siálico. Se informó que la eliminación del ácido siálico de la IgG anticancerígena Campath-1H no tenía efecto sobre la actividad de ADCC, pero pareció que los glicanos de Fc sobre la preparación de mAb original que se usó como referencia estaban menos del 10 % sialilados, dificultando detectar cualquier efecto (Boyd et al., 1995) . Similarmente, Wright y Morrison (1998) informaron de diferencia no discernible en la unión de FcγRI entre un Ab IgG1 expresado en una línea celular CHO mutante que era defectuosa en la sialilación y el mismo Ab expresado en una línea celular CHO no mutante. Sin embargo, la cantidad de ácido siálico presente en el Ab de células no mutantes fue probablemente bastante bajo (Wright et al., 2000) y, por tanto, cualquier diferencia en la unión entre Ab sialilados y asialilados también sería difícil de detectar. Mimura et al., (2000) compararon la actividad de Fc de Ab IgG1-Fc y IgG1 nativos (heterogéneos) en comparación con el mismo material después del tratamiento con tanto sialidasa como beta-galactosidasa, pero no trataron con sialidasa sola, que hubiera permitido un análisis de los efectos del ácido siálico. Un Ab IgG3 humano mutado y altamente sialilado (mediante enlace α2, 3) (Lund et al., 1996 arriba) fue 2 a 3 veces menos activo que su homólogo de baja sialilación no mutante en ensayos de lisis del complemento, y ensayos funcionales dependientes de FcγRI y dependientes de FcγRII, pero una variante altamente sialilada del mismo Ab que contuvo una mezcla de dos enlaces de ácido siálico (α2, 3 y α2, 6) mostró actividades comparables al no mutante (Jassal et al.,... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para controlar las propiedades de una molécula que contiene Fc, que comprende alterar la sialilación de los oligosacáridos en la región Fc en la glicoforma sialilada G2S2, en el que la sialilación aumenta en la región Fc, en el que la sialilación se altera de la región Fc no mutante por tratamiento enzimático o modificación enzimática de la molécula por una α- (2, 3) -sialiltransferasa, y en el que las propiedades controladas están seleccionadas del grupo que consiste en afinidad por uno o más de los receptores FcγRI, FcγRIIA y FcγRIIIA, actividad de ADCC, activación de macrófagos o monocitos, semivida en suero y avidez.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la molécula que contiene Fc tiene un dominio de unión específico para una diana, siendo la diana una diana inmovilizada.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la molécula que contiene Fc tiene un dominio de unión específico para una diana, siendo la diana expresada sobre la superficie de una célula. 15

4. El método de la reivindicación 1, en el que la molécula que contiene Fc es un anticuerpo.

5. Un método in vitro para controlar las propiedades de una proteína terapéutica que contiene Fc caracterizada por tener un oligosacárido biantenario covalentemente unido a un residuo de asparagina en el dominio CH2 de 20 inmunoglobulina de dicha proteína, que comprende convertir una proteína terapéutica que contiene Fc no de la glicoforma G2S2 en un oligosacárido que es de la glicoforma sialilada G2S2, en el que la etapa de conversión comprende usar una α- (2, 3) -sialiltransferasa para añadir residuos de ácido siálico, y en el que dicha proteína que contiene Fc tiene una o más de las propiedades seleccionadas del grupo que consiste en afinidad reducida por FcγRIIA y FcγRIIIA, actividad reducida en ensayos de ADCC mediados por linfocitos NK, afinidad mejorada por

FcγRI, capacidad mejorada para activar macrófagos y semivida en suero más corta en comparación con la misma proteína terapéutica que contiene Fc no de la glicoforma G2S2.

6. Una proteína que contiene Fc producida o alterada por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Una proteína terapéutica que contiene Fc caracterizada por tener un oligosacárido biantenario covalentemente unido a un residuo de asparagina en el dominio CH2 de inmunoglobulina de dicha proteína que es de la glicoforma sialilada de α- (2, 3) G2S2, en la que dicha proteína que contiene Fc tiene afinidad reducida por FcγRIIA y FcγRIIIA, actividad reducida en ensayos de ADCC mediados por linfocitos NK, afinidad mejorada por FcγRI, capacidad mejorada para activar macrófagos y semivida en suero más corta en comparación con una preparación de la misma proteína terapéutica que contiene Fc en las glicoformas no sialiladas G0, G1 o G2.

8. La proteína de la reivindicación 7, en la que la diana unida por el dominio de unión a diana de la proteína es una diana inmovilizada.

9. La proteína de la reivindicación 7, en la que la diana unida por el dominio de unión de la proteína se expresa sobre la superficie de una célula.

10. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en la que la proteína se indica para el tratamiento de trastornos relacionados con la oncología, enfermedades crónicas o enfermedades infecciosas. 45

11. La proteína de la reivindicación 10, en la que las enfermedades infecciosas implican aclaramiento mediado por FcR de células opsonizadas por anticuerpos o partículas que comprenden uno o ambos de los virus y bacterias y las enfermedades crónicas que requieren tratamiento a largo plazo.

12. La proteína de la reivindicación 7, en la que la proteína comprende un anticuerpo monoclonal recombinantemente expresado o un anticuerpo enzimáticamente modificado usando sialiltransferasas.

13. La proteína de la reivindicación 7, en la que la proteína está seleccionada del grupo que consiste en Ab1, Ab2,

Ab3 o Ab5. 55

14. Un método in vitro para preparar un lote de proteína recombinante terapéutica que contiene Fc de la glicoforma sialilada G2S2 caracterizada por comprender un dominio de isotipo IgG de inmunoglobulina de al menos una región bisagra, dominio CH2 y CH3, en el que el método comprende tratar el lote con una enzima α- (2, 3) -sialiltransferasa para añadir residuos de ácido siálico a las cadenas de polisacárido unidas a dicha proteína.

15. Una composición farmacéutica que comprende una proteína producida por el método de la reivindicación 14 en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. La proteína producida por el método de la reivindicación 14 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o 65 afección.

17. La proteína producida por el método de la reivindicación 14 para su uso in vivo en el diagnóstico de una

enfermedad o afección.

18. La proteína de la reivindicación 16, en la que dicha proteína se usa para tratar una enfermedad neoplásica

5 seleccionada del grupo que consiste en un carcinoma, un linfoma, un sarcoma y un mieloma.

19. La proteína de la reivindicación 16, en la que dicha proteína se usa para tratar un trastorno inflamatorio

seleccionado del grupo que consiste en psoriasis, artritis reumatoide, colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria del

intestino, enfermedad de Crohn y lupus eritematoso sistémico.

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20. La proteína de la reivindicación 16, en la que la proteína se usa para tratar trastornos que implican

neovascularización de la córnea o de la retina.

21. Un método in vitro para controlar una afinidad de unión por una diana de una molécula que contiene Fc que tiene

15 un dominio de unión específico para la diana, que comprende alterar la sialilación de los oligosacáridos en la región

Fc en la glicoforma sialilada G2S2, en el que la sialilación aumenta en la región Fc y la avidez disminuye, y en el que

la sialilación se altera de la región Fc no mutante por tratamiento enzimático o modificación enzimática de la

molécula con una α- (2, 3) -sialiltransferasa.

20 22. El método de la reivindicación 21, en el que la diana es una diana inmovilizada.

23. El método de la reivindicación 21, en el que la diana se expresa sobre la superficie de una célula

24. El método de la reivindicación 21, en el que la molécula que contiene Fc es un anticuerpo.

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25. Un método in vitro que comprende la proteína producida por el método de la reivindicación 14 para diagnosticar

una enfermedad o afección.

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