Métodos para aislar ácidos nucleicos.

Un método para la purificación de un ácido nucleico, que comprende las etapas de:

(a) adsorber en un sustrato mineral poroso o no poroso seleccionado del grupo que consiste en gel de sílice, fibras de vidrio, fibras de cuarzo, zeolitas y partículas con atracción magnética recubiertas con vidrio la secuencia de ácido nucleico independientemente de una composición que contiene

(i) un tampón acuoso,

(ii) sales en una concentración igual a o mayor de 1 M,

(iii) un compuesto orgánico no ácido miscible en agua que comprende un grupo funcional de Fórmula I, W ≡ Z (Fórmula I)

en la que W es un átomo de carbono o un átomo de azufre y Z es un átomo de oxígeno o un átomo de nitrógeno,

en el que el grupo funcional se selecciona del grupo que consiste en un grupo oxo, un grupo sulfoxo, un grupo ciano, y un grupo carbonilo de una función carbamoilo o una amida pero que no pertenece a una función carboxi, y

el compuesto orgánico no ácido miscible en agua se selecciona del grupo que consiste en acetilacetona, dimetilsulfóxido, dietilcetona, metiletilcetona, metilpropilcetona, isobutilmetilcetona, gamma-butirolactona, gamma-valerolactona, propilencarbonato y N-metil-2-pirrolidona y

en el que la composición de la etapa (a) contiene del 1 al 50 por ciento en volumen del compuesto orgánico no ácido miscible en agua, y el compuesto orgánico no ácido miscible en agua se disuelve para formar una fase líquida homogénea, y

(iv) el ácido nucleico;

(b) opcionalmente lavar con una solución de lavado el sustrato con el ácido nucleico adsorbido; seguido de

(c) poner en contacto el sustrato con el ácido nucleico adsorbido con una solución que contiene sales en una concentración menor en comparación con la composición de la etapa (a), desorbiendo de este modo el ácido nucleico del sustrato; y

(d) separar la solución con el ácido nucleico desorbido del sustrato, purificando de este modo el ácido nucleico; y

opcionalmente

(e) precipitar el ácido nucleico desorbido de la solución de la etapa (d) y aislar el ácido nucleico precipitado, purificando de este modo adicionalmente el ácido nucleico.

Métodos para aislar ácidos nucleicos

La presente Invención se refiere a la purificación de un ácido nucleico. Particularmente, la Invención se refiere a métodos para adsorber un ácido nucleico presente en una solución de adsorción acuosa en un sustrato sólido.

Muchas sustancias biológicas, especialmente ácidos nucleicos, presentan retos especiales con respecto a su aislamiento de su ambiente natural. Por un lado, están presentes con frecuencia en concentraciones muy pequeñas y, por otro lado, se encuentran frecuentemente en presencia de muchas otras sustancias sólidas y disueltas por ejemplo después de la lisis de células. Esto los hace difícil de aislar o medir, en particular en ensayos bloespecíficos que permiten la detección de ácidos nucleicos específicos, o la detección de propiedades específicas de un ácido nucleico. Dichos ensayos bioespecíficos desempeñan un papel Importante en el campo del diagnóstico y la bloanalítlca en investigación y desarrollo. Son ejemplos para ensayos bloespecíficos los ensayos de hibridación, inmunoensayos y ensayos de receptor-ligando. Los ensayos de hibridación usan la formación de pares de bases específica para la detección molecular de analitos de ácido nucleico, por ejemplo ARN y ADN. Por lo tanto, las sondas ollgonucleotídicas con una longitud de 18 a 20 nucleótidos pueden permitir el reconocimiento específico de una secuencia complementarla seleccionada por ejemplo en el genoma humano. Otro ensayo que implica la unión selectiva de dos cebadores ollgonucleotídlcos es la reacción en cadena de la pollmerasa (PCR) descrita en el documento US 4.683.195. Este método permite la amplificación selectiva de una reglón de ácido nucleico específica hasta niveles detectables por una pollmerasa termoestable en presencia de desoxlnucleótldos trifosfatos en varios ciclos.

Como se ha descrito anteriormente, antes de poder analizar los ácidos nucleicos en uno de los ensayos anteriormente mencionados o usarse para otros procesos, tienen que aislarse o purificarse a partir de muestras biológicas que contienen mezclas complejas de diferentes componentes como por ejemplo componentes proteicos y no proteicos. Con frecuencia, para las primeras etapas, se usan procesos que permiten el enriquecimiento del componente de Interés, es decir los ácidos nucleicos. Frecuentemente, estos están contenidos en una célula bacteriana, una célula fúngica, una partícula viral o la célula de un organismo más complejo, tal como una célula de sangre humana o una célula vegetal. Los ácidos nucleicos como componente de interés también pueden denominarse "componente diana".

Para liberar los contenidos de dichas células o partículas, se pueden tratar con enzimas o con productos químicos para disolver, degradar o desnaturalizar las paredes celulares y las membranas celulares de dichos organismos. Este proceso se denomina habitualmente lisis. La solución resultante que contiene dicho material lisado se denomina Usado. Un problema que se encuentra con frecuencia durante la lisis es que otras enzimas que degradan el componente diana, por ejemplo desoxirribonucleasas o rlbonucleasas que degradan ácidos nucleicos, entran en contacto con el componente diana durante la lisis. Estas enzimas degradantes también pueden estar presentes fuera de las células o pueden haberse separado espacialmente en diferentes compartimentos celulares antes de la lisis y entrar ahora en contacto con el componente diana. Otros componentes liberados durante este proceso pueden ser por ejemplo endotoxlnas que pertenecen a la familia de llpopollsacárldos que son tóxicos para células y pueden provocar problemas para productos que se pretende usar en terapia humana o animal.

En las siguientes etapas de la preparación de muestras que continúa en la etapa de lisis, los ácidos nucleicos se enriquecen adicionalmente. Los ácidos nucleicos se extraen normalmente de las mezclas de lisis complejas antes de usarse en un ensayo basado en sondas. Hay varios métodos para la extracción de ácidos nucleicos. Los métodos dependientes de secuencia o bloespecíficos incluyen, por ejemplo, cromatografía de afinidad o hibridación con sondas inmovilizadas. Los métodos independientes de secuencia o físico-químicos Incluyen, por ejemplo, extracción de líquido-líquido con fenol-cloroformo, precipitación con etanol puro o isopropanol, extracción con papel de filtro, extracción con agentes formadores de micelas como cetil-trimetil-amomo-bromuro, unión con colorantes inmovilizados, de intercalación tales como derivados de acridina, adsorción en sustratos tales como gel de sílice o tierras diatomeas, adsorción en partículas de vidrio que pueden atraerse magnéticamente (MGP) o partículas de organo silano en condiciones caotrópicas. Se prefiere la unión directa de los ácidos nucleicos con un sustrato tal como un material con una superficie de sílice porque entre otras razones los ácidos nucleicos no tienen que modificarse e incluso pueden unirse a ácidos nucleicos nativos.

Es particularmente interesante para fines de extracción la adsorción de ácidos nucleicos en una superficie de vidrio aunque son posibles otras superficies.

Se han propuesto muchos procedimientos para aislar ácidos nucleicos de su ambiente natural en años recientes mediante el uso de su comportamiento de unión con sustratos tales como superficies de vidrio. Es habitual usar agentes caotrópicos tales como, por ejemplo, tiocianato de guanidina o detergentes aniónicos, catiónicos, zwitteriónicos o no iónicos cuando se pretende liberar ácidos nucleicos. También es una ventaja usar proteasas que degradan rápidamente estas enzimas o proteínas no deseadas. Los ácidos nucleicos que se liberan, por ejemplo, después de lisis celular y/o lisis de orgánulos celulares tales como mitocondrias, plástidos, núcleos u otros orgánulos que contienen ácido nucleico, pueden purificarse por medio de la unión con un sustrato tal como un soporte mineral,

lavando dicho soporte mineral con los ácidos nucleicos unidos y liberando, es decir desorbiendo dichos ácidos nucleicos de dicho soporte mineral. Para una etapa de lavado el experto en la materia elige las condiciones en las que los ácidos nucleicos permanecen adsorbidos en el soporte mineral. Preferentemente, más del 40 %, más preferentemente más del 50 %, más preferentemente más del 70 %, más preferentemente más del 80 %, aún más preferentemente más del 90 %, aún más preferentemente más del 95 %, aún más preferentemente más del 99 % de los ácidos nucleicos permanecen adsorbidos en el soporte mineral. Para la etapa de desorción el experto en la materia elige las condiciones en las que los ácidos nucleicos se liberan del soporte mineral. Preferentemente, más del 40 %, más preferentemente más del 50 %, más preferentemente más del 70 %, más preferentemente más del 80 %, aún más preferentemente más del 90 %, aún más preferentemente más del 95 %, aún más preferentemente más del 99 % de los ácidos nucleicos se liberan del soporte mineral.

Se conoce en la técnica la adsorción de ácidos nucleicos con partículas de vidrio o partículas de sílice en presencia de sales caotróplcas (Vogelstein, B., y Gillespie, D., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76 (1979) 615-619) y proporciona la base de los procesos de purificación y separación cromatográficos para ácidos nucleicos. También se conocen en la técnica métodos para aislar y purificar ARN y ADN de lisados usando altas concentraciones de sales caotrópicas, por ejemplo, yoduro sódico, perclorato sódico y tiocianato de guanidina (Boom, R., et al., J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 495-503; Yamada, O., et al., J. Viral. Methods 27 (1990) 203-209). La purificación de ADN plasmídico de bacterias en partículas de vidrio en presencia de perclorato sódico se describe en Marko, M.A., et al., Anal. Biochem. 121 (1982) 382-387. En el documento DE 37 24 442, se describe el aislamiento de ADN de fago M13 monocatenario en filtros de fibra de vidrio precipitando partículas de fago usando ácido acético y lisis de las partículas de fago con perclorato. Los ácidos nucleicos unidos a los filtros de fibra de vidrio se lavan y después se eluyen con un tampón de Tris/EDTA que contiene metanol. Se describe un procedimiento similar para purificar ADN de fagos lambda en Jakobi, R., et al., Anal. Biochem. 175 (1988) 196-201. El procedimiento implica la unión selectiva de ácidos nucleicos con superficies de vidrio en soluciones de sal caotrópica y separar los ácidos nucleicos de contaminantes tales como agarosa, proteínas o residuos celulares. Para separar las partículas de vidrio de los contaminantes, las partículas pueden centrifugarse o se extraen fluidos a través de filtros de fibra de vidrio. Hay una etapa limitante, sin embargo,... [Seguir leyendo]

1. Un método para la purificación de un ácido nucleico, que comprende las etapas de:

(a) adsorber en un sustrato mineral poroso o no poroso seleccionado del grupo que consiste en gel de sílice, fibras de vidrio, fibras de cuarzo, zeolitas y partículas con atracción magnética recubiertas con vidrio la secuencia de ácido nucleico independientemente de una composición que contiene

(i) un tampón acuoso,

(¡i) sales en una concentración igual a o mayor de 1 M,

(i¡¡) un compuesto orgánico no ácido miscible en agua que comprende un grupo funcional de Fórmula I,

W = Z (Fórmula I)

en la que W es un átomo de carbono o un átomo de azufre y Z es un átomo de oxígeno o un átomo de nitrógeno,

en el que el grupo funcional se selecciona del grupo que consiste en un grupo oxo, un grupo sulfoxo, un grupo ciano, y un grupo carbonilo de una función carbamoilo o una amida pero que no pertenece a una función carboxi, y

el compuesto orgánico no ácido miscible en agua se selecciona del grupo que consiste en acetilacetona, dimetilsulfóxido, dietilcetona, metiletilcetona, metilpropilcetona, isobutilmetilcetona, gamma-butirolactona, gamma-valerolactona, propilencarbonato y N-metil-2-pirrolidona y

en el que la composición de la etapa (a) contiene del 1 al 50 por ciento en volumen del compuesto orgánico no ácido miscible en agua, y el compuesto orgánico no ácido miscible en agua se disuelve para formar una fase líquida homogénea, y (iv) el ácido nucleico;

(b) opcionalmente lavar con una solución de lavado el sustrato con el ácido nucleico adsorbido; seguido de

(c) poner en contacto el sustrato con el ácido nucleico adsorbido con una solución que contiene sales en una concentración menor en comparación con la composición de la etapa (a), desorbiendo de este modo el ácido nucleico del sustrato; y

(d) separar la solución con el ácido nucleico desorbido del sustrato, purificando de este modo el ácido nucleico; y opcionalmente

(e) precipitar el ácido nucleico desorbido de la solución de la etapa (d) y aislar el ácido nucleico precipitado, purificando de este modo adicionalmente el ácido nucleico.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que

la composición de la etapa (a) contiene del 3 al 30 por ciento en volumen del compuesto orgánico no ácido miscible en agua.

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por que

las sales en la composición de la etapa (a) son sales caotrópicas en concentraciones de 1 a 8 M y dichas sales caotrópicas se seleccionan del grupo que consiste en perclorato sódico, clorhidrato de guanidina, tiocianato de guanidina, isotiocianato de guanidina y yoduro sódico.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por que las sales en la composición de la etapa (a) están en concentraciones de 1 a 10 M y dichas sales se seleccionan del grupo que consiste en cloruro de litio, cloruro sódico, cloruro potásico, acetato sódico, urea y mezclas de los mismos.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que

la solución de lavado de la etapa (b) contiene el compuesto orgánico no ácido miscible en agua.

6. El método de la reivindicación 5, caracterizado por que

la solución de lavado de la etapa (b) contiene entre 1 y 100 por ciento en volumen del compuesto orgánico no ácido miscible en agua.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el compuesto orgánico no ácido miscible en agua es gamma-butirolactona y el sustrato mineral consiste en fibras de vidrio.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el ácido nucleico es ARN y el compuesto orgánico no ácido miscible en agua es N-metil-2-pirrolidona.