Método para producir y purificar una sialiltransferasa soluble activa.

Un método para producir un polipéptido de sialiltransferasa, que comprende las etapas de:

a) expresar un polipéptido de sialiltransferasa en células CHO; recoger el medio de cultivo celular que contiene el polipéptido de sialiltransferasa expresado; y

b) purificar el polipéptido de sialiltransferasa del medio de cultivo celular sometiendo el medio de cultivo celular a (i) dos etapas de cromatografía de afinidad o una etapa de cromatografía de afinidad y una etapa de cromatografía de modo mixto, (ii) una etapa de cromatografía de intercambio aniónico, y (iii) una etapa de cromatografía de intercambio catiónico,

en el que la sialiltransferasa es ST6GalNAcI.

Método para producir y purificar una sialiltransferasa soluble activa Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para la producción y la purificación de un polipéptido de N- acetilgalactosamina (GalNAc)-alfa-2,6-sialiltransferasa I (ST6GalNAcl). El método comprende las etapas de producir el polipéptido de la sialiltransferasa en células de ovario de hámsger chino (CHO) y purificar el polipéptido con una combinación de etapas de cromatografía. El método produce un alto rendimiento del polipéptido de sialiltransferasa que es muy puro y enzimáticamente activo. La ST6GalNAcl obtenida puede emplearse para la glicosilación de proteínas terapéuticas, tales como G-CSF.

Antecedentes de la invención

En la naturaleza aparece una gran diversidad de estructuras de oligosacáridos y muchos tipos de glicopéptidos, y estos son sintetizados, en parte, por un gran número de glicosiltransferasas. Las glicosiltransferasas catalizan la síntesis de glicolípidos, glicopéptidos y polisacáridos transfiriendo un resto mono- u oligosacárido activado desde un donante a una molécula aceptara existente para iniciar o alargar una cadena de carbohidrato. Se cree que está implicada una reacción catalítica en el reconocimiento del donante y del aceptor por los dominios adecuados de la glicosiltransferasa, así como el sitio catalítico de la enzima.

Más del 30% de todas las proteínas terapéuticas y muchos compuestos terapéuticos peptídicos potenciales son péptidos glicosilados. En la técnica se sabe que la unión de la estructura de glicano correcta puede desempeñar un papel clave en el plegamiento, la actividad biológica, la biodistribución y la eficacia farmacológica de los péptidos terapéuticos. Además, la glicosilación es un factor críticamente importante que influye en la semivida in vivo y la inmunogenicidad de los péptidos terapéuticos. En efecto, los seres humanos generalmente solo toleran los productos bioterapéuticos que presentan tipos concretos de uniones de cerbohidratos y a menudo rechazan a las glicoproteínas que incluyen uniones de oligosacáridos que no son típicas de mamíferos. Por ejemplo, los péptidos poco glicosilados son reconocidos por el hígado como "viejos" y, así, son eliminados con más rapidez del cuerpo que los péptidos glicosilados de modo adecuado. Por contraste, los péptidos hiperglicosilados o los péptidos glicosilados de modo incorrecto pueden ser inmunogénicos.

La producción de un glicopéptido recombinante, por contraste con un péptido no glicosilado recombinante, requiere que un péptido producido de modo recombinante se someta a etapas de procesamiento adicionales, in vivo dentro de la célula o in vitro después de que el péptido haya sido producido por la célula. El péptido puede tratarse de modo enzimático, empleando una glicosiltransferasa para introducir uno o más grupos glicosilo sobre el péptido mediante la unión covalente del grupo o grupos glicosilo al péptido.

La producción de un glicopéptido mediante etapas externas in vitro del procesamiento del péptido puede ser larga y costosa. Esto es debido, en parte, a la carga y al coste de producir glicosiltransferasas recombinantes para la glicosilación in vitro de péptidos y glicopéptidos para producir compuestos terapéuticos de glicopéptidos. A medida que aumenta la demanda y el uso de productos glicoterapéuticos recombinantes, son necesarios nuevos métodos para preparar glicopéptidos con más eficacia.

Además, a medida que se descubren más glicopéptidos útiles para el tratamiento de una diversidad de enfermedades, son necesarios métodos que disminuyan el coste de su producción. Además, en la técnica también es necesario desarrollar métodos para producir glicopéptidos recombinantes con más eficacia para su uso en el desarrollo y la mejora de los productos terapéuticos de glicopéptidos.

En el documento W02003/031464A2 se describen glicosiltransferasas y su uso para la glicosilación de proteínas.

Las sialiltransferasas constituyen una familia de glicosiltransferasas que catalizan la transferencia postraduccional del ácido siálico (ácido A/-acetilneuramínico) a los sustratos de oligosacáridos aceptores en las posiciones terminales sobre las glicoproteínas y los glicolípidos (Paulson et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:17615-17618). Se calcula que el genoma humano codifica más de 20 sialiltransferasas diferentes necesarias para sintetizar todas las estructuras de sialooligosacáridos conocidas presentes en células de mamífero, pero solo se han clonado 16 ADNc de sialitransferasas humanas diferenciadas (Tsuji S. et al., 1996, Glycobiology, 6:5-7; Tsuji S., 1996, J. Biochem., 120:1-13; Weinstein J. et al., 1982, J. Biol. Chem., 257:13835-13844). Originariamente, las sialiltransferasas se purificaron bioquímicamente y sus ADNc se clonaron empleando secuencias N-terminales. La comparación de las secuencias de ADNc obtenidas reveló dos regiones altamente conservadas, denominadas motivos L- y S-sialilo, que participan en la unión al sustrato. Después se han clonado varias sialiltransferasas mediante PCR empleando cebadores degenerados diseñados dentro de los motivos de sialilo o mediante clonación de expresión (Nara K. et al., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91:7952-7956; Nakayama J. et al., 1996, J. Biol. Chem., 271:3684-3691; Nakayama J. et al., 1995, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 92:7031-7035). La clonación de genes mediante presentación diferencial añade una estrategia totalmente diferente a la identificación de nuevas sialiltransferasas con importancia funcional putativa en procesos relacionados con enfermedades.

El documento US 6.280.989 describe la clonación de diferentes sialiltransferasas humanas y de ratón y diferentes métodos para purificar estas sialiltransferasas. Sticher et al. (1991), Glyconjugate Journal, 8(1):45-54, describen la purificación de una sialiltransferasa a partir de hígado humano.

Las sialiltransferasas se diferencian en su especifidad de sustrato y en la distribución tisular, y se clasifican en cuatro familias según los enlaces de carbohidratos que sintetizan: las familias ST3Gal, ST6Gal, STÓGalNAc, y ST8Sia. Los miembros de cada familia muestran una fuerte actividad hacia ciertos grupos aceptores, aunque las especificidades de sustrato de estas enzimas se solapan; un enlace puede ser sintetizado por múltiples enzimas.

Una de estas sialiltransferasas concreta que tiene utilidad en el desarrollo y la producción de glicopéptidos terapéuticos es la A/-acetilgalactosamina-a2,6-sialiltransferasa (ST6GalNAcl), que cataliza la transferencia del ácido siálico desde un donante de ácido siálico hasta un aceptar de ácido siálico. La enzima ST6GalNAcl de pollo de longitud completa se describe, por ejemplo, en Kurosawa et al. (1994, J. Biol. Chem., 269:1402-1409).

En el pasado, se ha intentado aumentar la disponibilidad de sialiltransferasas recombinantes para la producción in

vitro de glicopéptidos.

Los documentos EP 0 737 745 A1 y U.S. 5.032.519 de the Instituto of Physical & Chemical Research se refieren al uso de E. coli para producir una versión segregada de una proteína que comprende una porción, concretamente un dominio activo, que se deriva de ST6GalNAcl y que es responsable de su actividad.

El documento WO 2007/056524 A2 de Neose Technologies Inc. describe métodos para producir un polipéptido de ST6GalNAcl modificado, comprendiendo dicho método cultivar una célula hospedante procariota recombinante bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido de ST6GalNAcl modificado en las células hospedantes procariotas. Estos polipéptidos de ST6GalNAcl modificados son polipéptidos quiméricos que comprenden una primera porción de un polipéptido de Gal-pi,3GalNAc-a2,3-sialiltransferasa (ST3Gall) y una segunda porción de un polipéptido de GalNAc-a-2,6-sialiltransferasa I (ST6GalNAcl). Los polipéptidos de ST6GalNAcl modificados también pueden ser polipéptidos truncados que carecen del dominio de señal de ST6GalNAcl completo, o de una porción de este, del dominio transmembrana de ST6GalNAcl completo, o de una porción de este, y/o del dominio troncal de ST6GalNAcl completo, o de una porción de este, en células hospedantes eucariotas o procariotas.

El documento US 2006/0234345 A1 de Neose Technologies Inc. describe un método para producir una glicosiltransferasa eucariota soluble en un microorganismo procariota que está en un entorno oxidante, mediante a) la expresión de un ácido nucleico que codifica la glicosiltransferasa eucariota en el microorganismo procariota, y después, b) cultivar el microorganismo procariota bajo condiciones que permiten la expresión de la glicosiltransferasa eucariota activa soluble dentro de un compartimento... [Seguir leyendo]

1.- Un método para producir un polipéptido de sialiltransferasa, que comprende las etapas de:

a) expresar un polipéptido de sialiltransferasa en células CHO; recoger el medio de cultivo celular que contiene el polipéptido de sialiltransferasa expresado; y

b) purificar el polipéptido de sialiltransferasa del medio de cultivo celular sometiendo el medio de cultivo celular a (i) dos etapas de cromatografía de afinidad o una etapa de cromatografía de afinidad y una etapa de cromatografía de modo mixto, (ii) una etapa de cromatografía de intercambio aniónico, y (iii) una etapa de cromatografía de intercambio catiónico,

en el que la sialiltransferasa es ST6GalNAcl.

2.- El método según la reivindicación 1, en el que la ST6GalNAcl se selecciona del grupo que consiste en ST6GalNAcl humana, de chimpancé, de orangután, de cerdo, de vaca, de perro, de rata, de ratón y de pollo.

3.- El método según la reivindicación 2, en el que la ST6GalNAcl es una ST6GalNAcl de pollo.

4.- El método según la reivindicación 3, en el que el polipéptido de la ST6GalNAcl comprende una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO: 6.

5.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el polipéptido de sialiltransferasa solo comprende el dominio activo de la sialiltransferasa.

6.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se emplea un módulo de expresión que codifica una secuencia señal de EPO y una secuencia del polipéptido de sialiltransferasa para expresar el polipéptido de sialiltransferasa en células CHO.

7.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la etapa a) se realiza aplicando un desplazamiento de la temperatura de incubación de 37 °C +/- 1 °C a 32 °C +/- 1 °C después de alcanzar una densidad celular predefinida.

8.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la etapa b) se realiza en el siguiente orden:

i. una cromatografía de intercambio aniónico;

ii. una primera cromatografía de afinidad;

iii. una segunda cromatografía de afinidad o una cromatografía de modo mixto;

iv. una cromatografía de intercambio catiónico.

9.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la cromatografía de intercambio aniónico se realiza empleando una resina que porta un amonio cuaternario como grupo funcional.

10.- El método según la reivindicaciones 9, en el que la cromatografía de intercambio aniónico se realiza empleando un tampón de NaCI/Tris-HCI como eluyente, a un pH en el intervalo entre 7,0 y 8,0.

11.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la primera cromatografía de afinidad se realiza empleando una cromatografía de afinidad de tinte.

12.- El método según la reivindicación 11, en el que la primera cromatografía de afinidad se realiza empleando una resina Blue Sepharose Fast Flow.

13.- El método según la reivindicación 12, en el que la cromatografía de afinidad con Blue Sepharose se realiza empleando un tampón de clorhidrato de L-arginina/fosfato de potasio como eluyente a un pH en el intervalo entre 7,0 y 8,0.

14.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la cromatografía de modo mixto se realiza empleando una resina de hidroxiapatito.

15.- El método según la reivindicación 14, en el que la cromatografía de afinidad de hidroxiapatito se realiza empleando un tampón de NaCI/fosfato de potasio como eluyente, a un pH en el intervalo entre 6,3 y 7,3.

16.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la cromatografía de intercambio catiónico se realiza con una resina que contiene un material de intercambio catiónico de sulfopropilo.

17.- El método según la reivindicación 16, en el que la cromatografía de intercambio catiónico se realiza empleando

una resina SP-Sepharose High Performance.

18.- El método según la reivindicación 17, en el que la cromatografía de intercambio catiónico se realiza empleando un tampón de NaCI/fosfato de potasio como eluyente, a un pH en el intervalo entre 6,0 y 7,0.

19.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que la etapa b) se realiza en el siguiente 5 orden:

i. una cromatografía de intercambio aniónico que emplea una resina Q-Sepharose Fast Flow;

ii. una primera cromatografía de afinidad que emplea una resina Blue Sepharose Fast Flow;

iii. una cromatografía de modo mixto que emplea una resina de hidroxiapatito;

iv. una cromatografía de intercambio catiónico que emplea una resina SP-Sepharose High Performance.