Gen AXMI-150 de la delta-endotoxina y métodos para su uso.

Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene actividad plaguicida,

donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 1;

b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; y

c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.

Gen AXMI-15 de la delta-endotoxina y métodos para su uso.

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la biología molecular. Se proporcionan nuevos genes que codifican proteínas plaguicidas. Estas proteínas y las secuencias de ácidos nucleicos que las codifican son útiles en la preparación de formulaciones plaguicidas y en la producción de plantas transgénicas resistentes a las plagas.

Antecedentes de la invención

Bacillus thuríngiensis es una bacteria Gram positiva formadora de esporas que habita en el suelo, caracterizada por su capacidad para producir inclusiones cristalinas que son específicamente tóxicas para ciertos órdenes y especies de insectos, pero inocuas para plantas y otros organismos no considerados dianas. Por esta razón, las composiciones que incluyen cepas de Bacillus thuríngiensis o sus proteínas insecticidas se pueden usar como insecticidas aceptables para el medio ambiente para controlar las plagas agrícolas de insectos o los insectos vectores para varias enfermedades humanas o animales.

Los cristales proteínicos (Cry) (delta-endotoxinas) de Bacillus thuríngiensis tienen una potente actividad insecticida contra las larvas predominantemente de lepidópteros, dípteros y coleópteros. Estas proteínas han mostrado también actividad contra los órdenes de plagas de himenópteros, homópteros, ftirápteros, malófagos y ácaros, así como otros órdenes de invertebrados, tales como nematelmintos, platelmintos y sarcomastigóforos (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis Family Tree. In Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.) Estas proteínas se clasificaron originalmente como Cryl a CryV basándose principalmente en su actividad insecticida. Las clases principales fueron la específica de lepidópteros (I), la específica de lepidópteros y dípteros (II), la específica de coleópteros (III), la específica de dípteros (IV) y la específica de nematodos (V) y (VI). Las proteínas se clasificaron además en subfamilias; a las proteínas más estrechamente relacionadas con cada familia se le asignaron letras consecutivas tales como Cry1A, Cry1B, Cry1C, etc. A las proteínas todavía más estrechamente relacionadas dentro de cada grupo se les dieron nombres tales como Cry1C1, Gy1C2, etc.

Recientemente se ha descrito una nueva nomenclatura para los genes Cry basada en la homología de las secuencias de aminoácidos en lugar de en la especificidad del insecto diana (Crickmore et al., (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:87 - 813). En la nueva clasificación, a cada toxina se le asigna un único nombre que incorpora una categoría principal (un número arábigo), una categoría secundaria (una letra mayúscula), una categoría terciaria (una letra minúscula) y una categoría cuaternaria (otro número arábigo). En la nueva clasificación, en la categoría principal los números romanos han sido sustituidos por números arábigos. Las proteínas con una identidad de secuencia inferior al 45 % tienen diferentes categorías principales y los criterios para las categorías secundaria y terciaria son 78 % y 95 %, respectivamente.

La proteína cristal no presenta actividad insecticida hasta que ha sido ingerida y solubilizada en el intestino medio del insecto. La protoxina ingerida es hidrolizada por proteasas en el tracto digestivo del insecto en una molécula tóxica activa. (Hófte y Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242 - 255). Esta toxina se une a receptores localizados en el borde en cepillo apical en el intestino medio de las larvas diana y se inserta en la membrana apical creando canales o poros iónicos que producen la muerte de la larva.

Las delta-endotoxinas generalmente tienen cinco dominios de secuencia conservados y tres dominios estructurales conservados (véase, por ejemplo Maagd et al. (21) Trends Genetics 17:193 - 199). El primer dominio estructural conservado consta de siete hélices alfa y está implicado en la inserción en la membrana y la formación de poros. El dominio II consiste en tres láminas beta dispuestas en una configuración de llave griega, y el dominio III consiste en dos láminas beta antiparalelas en formación de "remolino" (de Maagd et al., 21, citado anteriormente). Los dominios II y III están implicados en el reconocimiento y la unión al receptor y, por tanto, se consideran determinantes de la especificidad de la toxina.

El documento WO 25/17383 se refiere a proteínas insecticidas secretadas y a composiciones génicas de Bacillus thuríngiensis y a usos de las mismas.

Debido a la devastación que los insectos pueden conferir y la mejora en el rendimiento al controlar las plagas de insectos, existe una necesidad continua de descubrir nuevas formas de toxinas plaguicidas.

Resumen de la invención

Se proporcionan composiciones y métodos para conferir actividad plaguicida a las bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas. También se hace referencia a composiciones que incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican secuencias para polipéptidos plaguicidas e insecticidas, vectores que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico y células huésped que comprenden los vectores. Las composiciones incluyen las secuencias de

polipéptidos plaguicidas. Las secuencias de nucleótidos se pueden utilizar en construcciones de ADN o casetes de expresión para la transformación y expresión en organismos, incluidos microorganismos y plantas. Las secuencias de nucleótidos o aminoácidos pueden ser secuencias sintéticas que se han diseñado para su expresión en un organismo, incluyendo, entre otros, un microorganismo o una planta. También se hace referencia a composiciones que comprenden bacterias transformadas, plantas, células vegetales, tejidos y semillas.

En particular, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican una proteína plaguicida. Adicionalmente, están incluidas las secuencias de aminoácidos correspondientes a la proteína plaguicida. En particular, esta invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 2 o una secuencia de nucleótidos expuesta en las SEC ID N°: 1, 3, 4, 5, 6 o 7. También se hace referencia a las secuencias de nucleótidos que son complementarias a una secuencia de nucleótidos de la invención o que hibridan con una secuencia de la invención.

Se proporcionan métodos para producir los polipéptidos de la invención y para usar dichos polipéptidos para controlar o destruir una plaga de lepidópteros, coleópteros, nematodos o dípteros. También se hace referencia a métodos y kits para detectar los ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención en una muestra.

Las composiciones y métodos de la invención son útiles para la producción de organismos con mayor resistencia o tolerancia a las plagas. Estos organismos y composiciones que comprenden los organismos son deseables para fines agrícolas. Las composiciones de la invención también son útiles para generar proteínas alteradas o mejoradas que tienen actividad plaguicida, o para detectar la presencia de proteínas o ácidos nucleicos plaguicidas en los productos u organismos.

Por consiguiente, esta invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de ácidos nucleicos que tiene actividad plaguicida, donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID N°: 1;

b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la

SEC ID N°: 2; y

c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2.

La invención proporciona además:

un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención, preferentemente que comprende adicionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo;

una célula huésped que contiene el vector de la invención, preferentemente que es:

(a) una célula huésped bacteriana; o

(b) una célula vegetal;

una planta transgénica que comprende la célula huésped vegetal de la invención, preferentemente donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, col, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza de semilla oleaginosa; y

una semilla transgénica que comprende la molécula de ácido... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene actividad plaguicida, donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID N°: 1;

b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2; y

c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, donde dicha molécula de ácido nucleico está unida operativamente a un promotor que dirige la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en una célula vegetal.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2, donde dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia sintética que se ha diseñado para su expresión en una planta.

4. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, 2 o 3, preferentemente que comprende adicionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo.

5. Una célula huésped que contiene el vector de la reivindicación 4, que es preferentemente:

(a) una célula huésped bacteriana; o

(b) una célula vegetal.

6. Una planta transgénica que comprende la célula huésped vegetal de la reivindicación 5, donde preferentemente dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, col, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza de semilla oleaginosa.

7. Una semilla transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1,2 o

3.

8. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, donde la secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en las SEC ID Nos: 3, 4, 5, 6 y 7.

9. Un polipéptido con actividad plaguicida, seleccionado del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2;

b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2; y

c) un polipéptido que está codificado por la SEC ID N°: 1,

preferentemente que comprende además secuencias de aminoácidos heterólogas.

1. Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 9, donde:

(a) dicha composición se selecciona del grupo que consiste en un polvo, un polvo fino, una bolita, un gránulo, un aerosol, una emulsión, un coloide y una solución;

(b) dicha composición se puede obtener mediante desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación, o concentración de un cultivo de células bacterianas; o

(c) dicha composición comprende del 1 % al 99 % en peso de dicho polipéptido.

11. Un método para controlar una población de plagas de lepidópteros, coleópteros, nematodos o dípteros que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad plaguicidamente eficaz de un polipéptido de la reivindicación 9.

12. Un método para destruir una población de plagas de lepidópteros, coleópteros, nematodos o dípteros que comprende poner en contacto dicha plaga con, o alimentar a dicha plaga con, una cantidad plaguicidamente eficaz de un polipéptido de la reivindicación 9.

13. Un método para producir un polipéptido con actividad plaguicida, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 4 en condiciones en las que se expresa la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido.

14. Una planta que tiene incorporado establemente en su genoma una construcción de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene actividad plaguicida, donde dicha secuencia de

nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID N°: 1;

b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la 5 SEC ID N°: 2; y

c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2;

donde dicha secuencia de nucleótidos está unida operativamente a un promotor que dirige la expresión de una 1 secuencia codificante en una célula vegetal.

15. Un método para proteger a una planta de una plaga, que comprende introducir en dicha planta o célula de la misma al menos un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido plaguicida, donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID N°: 1;

b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2; y

c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que 2 tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2,

donde preferentemente dicha planta produce un polipéptido plaguicida que tiene actividad plaguicida contra una plaga de lepidópteros, coleópteros, nematodos o dípteros.