Glutamina sintetasas bacterianas y métodos de uso.

Un polinucleótido que comprende una variante de SEC ID Nº: 1, donde dicho polinucleótido variante es al menos98% idéntico a SEC ID Nº:

1, que codifica un polipéptido que es resistente a inhibición por inhibidor de glutaminasintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº: 2.

Glutamina sintetasas bacterianas y métodos de uso

Campo de la invención La presente invención se refiere a biología molecular de plantas, particularmente a una nueva clase de enzimas glutamina sintetasa que confieren resistencia a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas.

Antecedentes de la invención Las plantas obtienen nitrógeno de su ambiente en forma de compuestos inorgánicos, concretamente nitrato y amoníaco captado desde las raíces, y N2 atmosférico reducido a amoníaco en nódulos de raíces que fijan nitrógeno. La primera etapa en la asimilación del nitrógeno inorgánico en forma orgánica implica predominantemente la incorporación de amoníaco con glutamato para formar glutamina, catalizada por la enzima glutamina sintetasa.

Varios herbicidas actúan inhibiendo la glutamina sintetasa vegetal. Un ejemplo típico de dicho compuesto es el análogo de ácido glutámico, glufosinato (o fosfinotricina) . Muchos de estos herbicidas inhiben la glutamina sintetasa presente en las plantas de cultivo así como en malas hierbas, limitando de este modo el uso de dichos compuestos como glufosinato. Puesto que la selectividad de herbicidas es importante en cualquier herbicida comercialmente útil, sería de gran interés poder conferir resistencia en plantas seleccionadas a dichos herbicidas no selectivos como glufosinato, así como a otros inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas.

Se conocen en la técnica enzimas que son resistentes a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas. La metiona sulfoximina (MSO) , un análogo de glutamato, es un inhibidor competitivo mixto de glutamina sintetasa de hoja de guisante (Leason et al. (1982) Phytochemistr y 21:855) . Se han presentado células de alfalfa resistentes a fosfinotricina (Newmark (1983) Nature 305:383-384) . La resistencia se debió a amplificación del gen de glutamina sintetasa (Donn et al. (1984) Journal of Molecular and Applied Genetics 2: 621-635) . El gen Bar, aislado de Streptomyces hygroscopicus, codifica la enzima fosfinotricina N-acetiltransferasa (PAT) . Este gen puede conferir resistencia a herbicidas de glufosinato porque PAT detoxifica fosfinotricina por acetilación, lo que produce un compuesto inactivo.

Se necesitan genes adicionales que sean resistentes a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas cuando la resistencia se deba a una mutación funcional en la enzima glutamina sintetasa, en lugar de una amplificación o inactivación por acetilación de la enzima.

Se reconocen los siguientes documentos:

-El documento US 5.098.838 se refiere a la expresión de glutamina sintetasa natural y mutante en hospedadores ajenos; -Miller et al (1981) Journal of Biological Chemistr y 256 (21) : 11307-1131, que se refiere a glutamina sintetasa resistente a L metionina SR sulfoximina de mutantes de Salmonella typhimurium; y -McClelland et al (2001) Nature 413 (6858) : 852-856 se refiere a la secuencia de genoma completa de Salmonella enterica serovar typhimurium LT2.

Sumario de la invención Se describen composiciones y métodos para conferir resistencia a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas en plantas, células, tejidos y semillas vegetales. Los polinucleótidos empleados en los diversos métodos y composiciones confieren resistencia a glufosinato. Las composiciones incluyen polinucleótidos que codifican polipéptidos resistentes a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas, vectores que comprenden dichos polinucleótidos y células hospedadoras que comprenden los vectores. Se describen composiciones que comprenden una secuencia codificante de un polipéptido que confiere resistencia o tolerancia a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas. También se hace referencia a composiciones que comprenden una secuencia codificante de un 55 polipéptido que da como resultado utilización de nitrógeno mejorada y/o rendimiento potenciado en una planta. Las secuencias codificantes pueden usarse en construcciones de ADN o casetes de expresión para transformación y expresión en organismos, incluyendo microorganismos y plantas. Las composiciones también comprenden bacterias, plantas, células, tejidos y semillas vegetales transformados.

La presente invención proporciona un polinucleótido que comprende una variante de SEC ID Nº: 1, donde dicho polinucleótido variante es al menos 98% idéntico a SEC ID Nº: 1, que codifica un polipéptido que es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº: 2.

La presente invención proporciona polinucleótidos aislados que comprenden SEC ID Nº: 1, así como variantes de la secuencia polinucleotídica expuesta en SEC ID Nº: 1 que son al menos 98% idénticos a SEC ID Nº: 1, que codifican un polipéptido que es resistente a inhibición por el inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº: 2. Las variantes incluyen SEC ID Nº: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, y la secuencia de nucleótidos de glutamina sintetasa depositada en un hospedador bacteriano con el número de referencia NRRL B-30930, depositada el 8 de junio de 2006 en la Autoridad de Depósito Internacional Colección de Cultivo de Investigación Agrícola (NRRL) , 1815 N. University Street, Peoria, Illinois 61604 Estados Unidos. La presente invención proporciona los polipéptidos correspondientes a esos polinucleótidos. En una realización, los polinucleótidos de la presente invención comprenden al menos una modificación entre los aminoácidos 125 a 175 o entre los aminoácidos 200 a 250 correspondientes a SEC ID Nº: 2, o al menos una modificación que da como resultado la pérdida de un sitio de adenilación.

La invención también proporciona

- un vector que comprende un polinucleótido de la invención;

- una célula hospedadora que contiene dicho vector; -una planta transgénica que comprende dicha célula hospedadora; -una semilla transformada que comprende un polinucleótido de la invención; -un polipéptido que comprende una variante de SEC ID Nº: 2, donde dicho polipéptido variante es al menos 98% idéntico a SEC ID Nº: 2, es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº: 2; y -el polipéptido de SEC ID Nº: 2.

La invención también proporciona un método para conferir resistencia a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas en una planta que comprende:

(i) transformar dicha planta con un polinucleótido que comprende una variante de SEC ID Nº: 1, donde dicho polinucleótido variante es al menos 98% idéntico a SEC ID Nº: 1, codifica un polipéptido que es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzimadeSECID Nº: 2; y

(ii) regenerar una planta transformada.

La invención proporciona además una planta que tiene incorporada de forma estable en su genoma una construcción de ADN que comprende un polinucleótido que comprende una variante de SEC ID Nº: 1, donde dicho polinucleótido variante es al menos 98% idéntico a SEC ID N º: 1, codifica un polipéptido que es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima deSEC ID Nº: 2.

Adicionalmente, la invención proporciona un método para combatir de forma selectiva malas hierbas en un campo que contiene una planta que tiene semillas plantadas o plantas que comprende las etapas de:

a) plantar las semillas o plantas que son resistentes a inhibidor de glutamina sintetasa herbicida como un resultado de que un polinucleótido que comprende una variante de SEC ID Nº: 1 se inserte en la semilla o planta, donde dicho polinucleótido variante es al menos 98% idéntico a SEC ID Nº: 1, codifica un polipéptido que es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida, y que tiene actividad enzimática mayor

que la de la enzima de SEC ID Nº: 2; y b) aplicar a las plantas y malas hierbas en un campo una concentración eficaz de un inhibidor de glutamina sintetasa herbicida para combatir las malas hierbas sin afectar significativamente a las plantas.

La invención también proporciona un método para mejorar la utilización de nitrógeno en una planta que comprende introducir en dicha planta un polinucleótido de acuerdo con la invención.

Descripción de las figuras Las Figuras 1A-1C muestran una alineamiento de la secuencia de nucleótidos de las variantes resistentes a 55 herbicida de glutamina sintetasa, incluyendo pAX3421m1 (SEC ID Nº: 4) , pAX3422m2 (SEC ID Nº: 6) ,... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido que comprende una variante de SEC ID Nº: 1, donde dicho polinucleótido variante es al menos 98% idéntico a SEC ID Nº: 1, que codifica un polipéptido que es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº: 2.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, donde dicho polipéptido comprende al menos una modificación entre los aminoácidos 125 y 175 o al menos una modificación entre los aminoácidos 200 a 250 correspondientes a SEC ID Nº: 2.

3. El polinucleótido de la reivindicación 2 que se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nº: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 47 o la secuencia de nucleótidos de resistencia a herbicida del inserto de ADN del plásmido depositado con el Nº de Referencia NRRL B-30930.

4. El polinucleótido de la reivindicación 1, donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene al menos una modificación que da como resultado la pérdida de un sitio de adenilación en dicho polipéptido.

5. El polinucleótido de la reivindicación 4 que se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nº: 43 y 45.

6. El polinucleótido de la reivindicación 1, donde dicho inhibidor de glutamina sintetasa herbicida comprende glufosinato.

7. El polinucleótido de la reivindicación 1, donde dicho polinucleótido es una secuencia sintética que se ha diseñado para expresión en una planta.

8. El polinucleótido de SEC ID Nº: 1.

9. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1.

10. El vector de la reivindicación 9, que comprende además un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo.

11. Una célula hospedadora que contiene el vector de la reivindicación 9.

12. La célula hospedadora de la reivindicación 11 que es una célula hospedadora bacteriana.

13. La célula hospedadora de la reivindicación 11 que es una célula vegetal.

14. Una planta transgénica que comprende la célula hospedadora de la reivindicación 13.

15. La planta de la reivindicación 14, que comprende además uno o más de un polinucleótido que codifica un gen de tolerancia a herbicida o un polinucleótido que codifica un gen de tolerancia a insectos.

16. La planta de la reivindicación 15, donde dicho gen de tolerancia a herbicida es un gen de EPSP sintasa.

17. La planta de la reivindicación 15, donde dicho gen de tolerancia a insectos es una endotoxina.

18. La planta de la reivindicación 14, donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza.

19. Una semilla transformada que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1.

20. Un polipéptido que comprende una variante de SEC ID Nº: 2, donde dicho polipéptido variante es al menos 98% idéntico a SEC ID Nº: 2, es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº: 2.

21. El polipéptido de la reivindicación 20, donde dicho polipéptido comprende al menos una modificación entre los aminoácidos 125 y 175 o al menos una modificación entre los aminoácidos 200 a 250 correspondientes a SEC ID Nº: 2.

22. El polipéptido de la reivindicación 19 que se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nº: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, o un polipéptido que está codificado por la secuencia de nucleótidos de resistencia a herbicida del inserto de ADN del plásmido depositado con el Nº de Referencia NRRL B30930.

23. El polipéptido de la reivindicación 20, donde dicho polipéptido comprende al menos una modificación que da como resultado la pérdida de un sitio de adenilación en dicho polipéptido.

24. El polipéptido de la reivindicación 23 que se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nº: 44 y 46.

25. El polipéptido de la reivindicación 22, donde dicho inhibidor de glutamina sintetasa herbicida comprende glufosinato.

26. El polipéptido de SEC ID Nº: 2.

27. Un método para conferir resistencia a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas en una planta que comprende:

(i) transformar dicha planta con un polinucleótido que comprende una variante de SEC ID Nº: 1, donde dicho polinucleótido variante es al menos 98% idéntico a SEC ID Nº: 1, codifica un polipéptido que es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº: 2; y

(ii) regenerar una planta transformada.

28. Un planta que tiene incorporada de forma estable en su genoma una construcción de ADN que comprende un polinucleótido que comprende una variante de SEC ID Nº: 1, donde dicho polinucleótido variante es al menos 98% idéntico a SEC ID Nº: 1, codifica un polipéptido que es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº: 2.

29. La planta de la reivindicación 28, donde dicho polipéptido comprende al menos una modificación entre los aminoácidos 125 y 175 o al menos una modificación entre los aminoácidos 200 a 250 correspondientes a SEC ID Nº: 2.

30. La planta de la reivindicación 29, donde dicho polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nº: 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 o 47.

31. La planta la reivindicación 28, donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene al menos una modificación que da como resultado la pérdida de un sitio de adenilación en dicho polipéptido.

32. La planta de la reivindicación 31, donde dicho polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nº: 43 y45.

33. La planta de la reivindicación 28, donde dicho inhibidor de glutamina sintetasa herbicida comprende glufosinato.

34. La planta de la reivindicación 28, que comprende además uno o más de un polinucleótido que codifica un gen de tolerancia a herbicida o un polinucleótido que codifica un gen de tolerancia a insectos.

35. La planta de la reivindicación 34, donde dicho gen de tolerancia a herbicida es un gen de EPSP sintasa.

36. La planta de la reivindicación 34, donde dicho gen de tolerancia a insectos es una endotoxina.

37. La planta de la reivindicación 28, donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza.

38. Un método para combatir de forma selectiva malas hierbas en un campo que contiene una planta que tiene semillas plantadas o plantas que comprende las etapas de:

a) plantar las semillas o plantas que son resistentes a inhibidor de glutamina sintetasa herbicida como resultado de que un polinucleótido que comprende una variante de SEC ID Nº: 1 se inserte en la semilla o planta, donde dicho polinucleótido variante es al menos 98% idéntico a SEC ID Nº: 1, codifica un polipéptido que es resistente a inhibición por inhibidor de glutamina sintetasa herbicida y que tiene actividad enzimática mayor que la de la enzima de SEC ID Nº: 2; y, b) aplicar a las plantas y malas hierbas en un campo una concentración eficaz de un inhibidor de glutamina sintetasa herbicida para combatir malas hierbas sin afectar significativamente a las plantas.

39. El método de la reivindicación 27 o 38, donde dicho polipéptido comprende al menos una modificación entre los aminoácidos 125 y 175 o al menos una modificación entre los aminoácidos 200 a 250 correspondientes a SEC ID Nº: 2.

40. El método de la reivindicación 39, donde dicho polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nº: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 o 47.

41. El método de la reivindicación 27 o 38, donde dicho inhibidor de glutamina sintetasa herbicida comprende glufosinato.

42. El método de la reivindicación 27 o 38, donde dicha planta o semilla comprende además uno o más de un polinucleótido que codifique un gen de tolerancia a herbicida o un polinucleótido que codifique un gen de tolerancia a insectos.

43. El método de la reivindicación 42, donde dicho gen de tolerancia a herbicida es un gen de EPSP sintasa.

44. El método de la reivindicación 42, donde dicho gen de tolerancia a insectos es una endotoxina.

45. Un método para mejorar el rendimiento en una planta en relación con un control que comprende introducir en dicha planta un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1.

46. El método de la reivindicación 45, donde dicho polinucleótido comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 47, o la secuencia de nucleótidos de resistencia a herbicida del inserto de ADN del plásmido depositado con el Nº de Referencia NRRL B-30930.

47. Un método para mejorar la utilización de nitrógeno en una planta que comprende introducir en dicha planta un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1.

48. El método de la reivindicación 47, donde dicho polinucleótido comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47,

o la secuencia de nucleótidos de resistencia a herbicida del inserto de ADN del plásmido depositado con el Nº de Referencia NRRL B-30930.

49. El método de la reivindicación 27, 38, 45 o 47, donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene al menos una modificación que da como resultado la pérdida de un sitio de adenilación en dicho polipéptido.

50. El método de la reivindicación 49, donde dicho polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nº: 43y 45.

FIG. 1C