AXMI-031, AXMI-039 ,AXMI-040 y AXMI-049, una familia de genes de endotoxina delta y métodos para su uso.

Una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo queconsiste en:

a) la secuencia de nucleotidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, o 37, o uncomplemento de la misma;

b) una secuencia de nucleotidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia denucleotidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, o 37, o un complemento de lamisma, en donde dicha secuencia de nucleotidos codifica un polipeptido que tiene actividad plaguicidacontra un nematodo parasito de plantas;

c) una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidosde los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38;

d) una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidosque tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de los SEQ ID NO: 2,8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25 , 27, 29, 31, 33, o 38, en donde dicha secuencia de nucleotidos codifica unpolipeptido que tiene actividad plaguicida contra un nematodo parasito de plantas; y,

e) la secuencia de nucleotidos de delta-endotoxina del inserto de ADN del plasmido depositado con el Num.de Acceso B-30935 o un complemento de la misma.

AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040 y AXMI-049, una familia de genes de endotoxina delta y métodos para su uso Campo de la invención Esta invención se refiere al campo de la biología molecular. Se proporcionan nuevos genes que codifican proteínas plaguicidas. Estas proteínas y las secuencias de ácidos nucleicos que las codifican son útiles en la preparación de formulaciones plaguicidas y en la producción de plantas transgénicas resistentes a las plagas.

Antecedentes de la invención El Bacillus thuringiensis es una bacteria del suelo formadora de esporas gram-positiva caracterizada por su capacidad para producir inclusiones cristalinas que son específicamente tóxicas para ciertos órdenes y especies de insectos, pero son inofensivas para las plantas y otros organismos no elegidos como diana. Por esta razón, las composiciones incluyendo cepas de Bacillus thuringiensis o sus proteínas insecticidas se pueden utilizar como insecticidas aceptables desde el punto de vista medioambiental para controlar plagas de insectos agrícolas o vectores de insectos para una variedad de enfermedades humanas o animales.

Las proteínas cristal (Cr y ) (delta-endotoxinas) de Bacillus thuringiensis tienen potente actividad insecticida predominantemente contra Lepidópteros, Dípteros, y larvas de Coleópteros. Estas proteínas también han mostrado actividad contra órdenes de plagas de Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga, y Acari, así como otras órdenes de invertebrados tales como Nematelmintos, Platelmintos, y Sarcomastigórfora (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. En Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y) . Estas proteínas se clasificaron originalmente como Cr y I a Cr y V basándose principalmente en su actividad insecticida. Las principales clases fueron específica de Lepidoptera (I) , específica de Lepidoptera y Diptera (II) , específica de Coleoptera (III) , específica de Diptera (IV) , y específica de nematodos (V) y (VI) . Las proteínas se clasificaron adicionalmente en subfamilias; a las proteínas más altamente relacionadas dentro de cada familia se les asignaron letras divisionales tales como Cr y lA, Cr y lB, Cr y lC, etc. A las proteínas aún más estrechamente relacionadas dentro de cada división se les dieron nombres tales como Cr y lC1, Cr y lC2, etc.

Se describió recientemente una nueva nomenclatura para los genes Cr y basándose en la homología de la secuencia de aminoácidos en lugar de la especificidad del insecto diana (Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813) . En la nueva clasificación, a cada toxina se le asigna un nombre exclusivo que incorpora un rango primario (un número arábigo) , un rango secundario (una letra mayúscula) , un rango terciario (una letra minúscula) , y un rango cuaternario (otro número arábigo) . En la nueva clasificación, los números romanos han sido cambiados por números arábigos en el rango primario. Las proteínas con una identidad de secuencia menor de 45% tienen diferentes rangos primarios, y los criterios para los rangos secundario y terciario son 78% y 95%, respectivamente.

La proteína de cristal no muestra actividad insecticida hasta que se ha ingerido y se solubiliza en el intestino medio del insecto. La protoxina ingerida es hidrolizada por proteasas en el tracto digestivo de insectos a una molécula tóxica activa. (Höfte y Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255) . Esta toxina se une a receptores apicales del borde en cepillo del intestino medio de las larvas e insectos diana y se inserta en la membrana apical creando canales iónicos o poros, dando como resultado la muerte de las larvas.

Las delta-endotoxinas generalmente tienen cinco dominios de secuencias conservadas, y tres dominios estructurales conservados (véase, por ejemplo, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199) . El primer dominio estructural conservado consta de siete hélices alfa y está implicado en la inserción en la membrana y la formación de poros. El dominio II consiste en tres láminas beta dispuestas en una configuración de llave griega, y el dominio III consiste en dos láminas beta antiparalelas en formación de tipo remolino (de Maagd et al., 2001, supra) . Los dominios II y III están implicados en el reconocimiento y la unión al receptor, y por tanto se consideran determinantes de la especificidad de la toxina.

Debido a la devastación que los insectos pueden conferir existe una necesidad continua de descubrir nuevas formas de delta-endotoxinas de Bacillus thuringiensis.

Compendio de la invención Se proporcionan composiciones y métodos para conferir resistencia a las plagas a las bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas. Las composiciones incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican las secuencias de polipéptidos de delta-endotoxinas, los vectores que comprenden esas moléculas de ácido nucleico, y células anfitrionas que comprenden los vectores. Las composiciones también incluyen las secuencias de polipéptidos de la endotoxina. Las secuencias de nucleótidos se pueden utilizar en constructos de ADN o casetes de expresión para la transformación y expresión en organismos, incluidos microorganismos y plantas. Las secuencias de nucleótidos o aminoácidos pueden ser secuencias sintéticas que han sido diseñadas para su expresión en un organismo, incluyendo, pero no limitado a, un microorganismo o una planta. Las composiciones también comprenden bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas transformadas.

En particular, se proporcionan moléculas aisladas de ácidos nucleicos correspondientes a las secuencias de ácidos nucleicos de las delta-endotoxinas. Adicionalmente, están incluidas las secuencias de aminoácidos correspondientes a los polinucleótidos. En particular, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38, una secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 1, 7,

9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37, o las secuencias de nucleótidos de delta-endotoxinas depositadas en el anfitrión bacteriano con el Núm. de acceso B-30935. Secuencias de nucleótidos que son complementarias a una secuencia de nucleótidos de la invención.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de 15 nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, o 37, o un complemento de la misma; b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, o 37, o un complemento de la misma, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas; c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38;

d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas; y, e) la secuencia de nucleótidos de delta-endotoxina del inserto de ADN del plásmido depositado con el Núm.

de Acceso B-30935 o un complemento de la misma.

La invención proporciona adicionalmente un polipéptido recombinante con actividad plaguicida, seleccionado del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38; b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38, en donde dicho polipéptido tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas;

c) un polipéptido que está codificado por la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37; d) un polipéptido que está codificado por una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos 95% a la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 , 30, 32, o 37, en donde... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, o 37, o un complemento de la misma; b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, o 37, o un complemento de la misma, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas; c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38; d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25 , 27, 29, 31, 33, o 38, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas; y, e) la secuencia de nucleótidos de delta-endotoxina del inserto de ADN del plásmido depositado con el Núm. de Acceso B-30935 o un complemento de la misma.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde dicha secuencia de nucleótidos está conectada operablemente a un promotor capaz de dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos en una célula vegetal.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2, en donde dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia sintética que ha sido diseñada para la expresión en una planta.

4. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, 2 o 3.

5. Un vector de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicho vector comprende adicionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo.

6. Una célula anfitriona que contiene el vector de la reivindicación 4.

7. La célula anfitriona de la reivindicación 5 que es una célula anfitriona bacteriana o una célula anfitriona vegetal.

8. Una semilla transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, 2 o 3.

9. Un polipéptido recombinante con actividad plaguicida, seleccionado del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38; b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38, en donde dicho polipéptido tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas; c) un polipéptido que es codificado por la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37; d) un polipéptido que es codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37, en donde dicho polipéptido tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas; y, e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de delta-endotoxina del inserto de ADN del plásmido depositado con el Núm. de Acceso B-30935.

10. Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 9, en donde opcionalmente dicha composición se selecciona del grupo que consiste en un polvo, espolvoreable, bolita, gránulo, aerosol, emulsión, coloide, y solución, y en donde opcionalmente dicha composición se prepara mediante la desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación, o concentración de un cultivo de células Bacillus thuringiensis, y en donde dicha composición comprende de aproximadamente 1% a aproximadamente 99% en peso de dicho polipéptido.

11. Un método para eliminar o controlar una población de plagas de lepidópteros o coleópteros que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad eficaz como plaguicida del polipéptido de la reivindicación 9.

12. Un método para producir un polipéptido con actividad plaguicida, que comprende cultivar la célula anfitriona de la reivindicación 5 en condiciones en las que se expresa la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido.

13. Una planta o célula vegetal que tiene incorporado establemente en su genoma un constructo de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene actividad plaguicida, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37; b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas; c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38; d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 , 31, 33, o 38, en donde dicho polipéptido tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas, y, e) la secuencia de nucleótidos de delta-endotoxina del inserto de ADN del plásmido depositado con el Núm. de Acceso B-30935, o un complemento de la misma;

en donde dicha secuencia de nucleótidos está conectada operablemente a un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante en una célula vegetal.

14. La planta o célula vegetal transgénica de la reivindicación 13, o la semilla transgénica de la reivindicación 8, en donde dicha planta o la semilla se selecciona del grupo que consiste de maíz, sorgo, trigo, col, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza.

15. Un método para proteger una planta de una plaga, que comprende introducir en dicha planta o célula de la misma al menos un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido plaguicida, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37; b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas; c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38; d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38, en donde dicho polipéptido tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas; y, e) la secuencia de nucleótidos de delta-endotoxina del inserto de ADN del plásmido depositado con el Núm. de acceso B-30935, o un complemento de la misma.

16. Un método para proteger una planta de una plaga de nematodos, que comprende:

a) proporcionar una planta o semilla de la misma que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica un polipéptido que tiene actividad plaguicida contra un nematodo parásito de plantas, en donde dicho polipéptido plaguicida se selecciona entre el grupo que consiste en; i) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38; ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 38; iii) un polipéptido que es codificado por la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, o 37; iv) un polipéptido que es codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 , 30, 32, o 37, y, v) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de delta-endotoxina del inserto de ADN del plásmido depositado con el Núm. de Acceso B-30935 o un complemento de la misma, y, b) cultivar dicha planta o semilla en un campo que contenga nemátodos parásitos de plantas.

17. El método de la reivindicación 15, donde dicho nematodo parásito de plantas es un nematodo del quiste y en el que opcionalmente dicho nematodo parásito de las plantas es Heterodera schactii.

18. El método de la reivindicación 15, 16, o 17, en donde dicha planta tiene un mayor rendimiento en comparación con una planta que no expresa una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido plaguicida.