Composiciones y métodos para la expresión de una secuencia de nucleótidos heteróloga en plantas.

Una célula vegetal monocotiledónea que tiene incorporado establemente en su genoma un casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido dirigido al cloroplasto (CTP),

en donde dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicho CTP está conectada operablemente a una secuencia de nucleótidos de interés, y en donde dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicho CTP se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 6;

b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 6, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un péptido de tránsito al cloroplasto;

c) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 7; y,

d) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 7, en donde dicha secuencia de aminoácidos es un péptido de tránsito al cloroplasto.

Composiciones y métodos para la expresión de una secuencia de nucleótidos heteróloga en plantas Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere al campo de la biología molecular de plantas, más concretamente a la identificación y uso de elementos reguladores en plantas.

Antecedentes de la invención [0002] La biogénesis del cloroplasto en las plantas depende de las actividades coordinadas de dos sistemas genéticos independientes localizados en el cloroplasto y el núcleo (véase Cline y Henr y (1996) , Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 1-26) . Las grandes proteínas constituyentes del cloroplasto son codificadas por los genes nucleares y se sintetizan citoplásmicamente como formas precursoras que contienen prolongaciones N-terminales conocidas como péptidos de tránsito. El péptido de tránsito es decisivo para el reconocimiento específico de la superficie del cloroplasto y en la mediación de la translocación post-traduccional de las pre-proteínas a través de la envoltura del cloroplasto y de allí a los diversos subcompartimentos diferentes dentro del cloroplasto (por ejemplo, el estroma, el tilacoide y la membrana del tilacoide) .

Los genes que se ha informado que tienen secuencias de péptidos de tránsito codificadas naturalmente en su extremo N-terminal incluyen la subunidad pequeña del cloroplasto de la ribulosa-1, 5-bisfosfatocarboxilasa (RuBisCo) , de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30: 769-780; Schnell, D. J. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266 (5) : 3335-3342; la 5- (enolpiruvil) shikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) , Archer et al. (1990) J. Bioenerg. y

Biomemb. 22 (6) :789-810; la triptófano sintetasa. Zhao, J. et al. (1995) J. Biol. Chem. 2 70 (11) :6081-6087; la plastocianina, Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272 (33) :20357-20363; la corismato sintasa, Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268 (36) :27477-27457; y la proteína de unión a clorofila a/b que recoge la luz (LHBP) , Lamppa y col. (1988) J. Biol. Chem. 263: 14996-14999, aunque no todas estas secuencias han sido útiles para la expresión heteróloga de proteínas dirigidas a cloroplastos en plantas superiores.

Compendio de la invención [0004] Se proporcionan composiciones y métodos para dirigir al cloroplasto polipéptidos en una planta. Las composiciones comprenden casetes de expresión que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia peptídica dirigida a cloroplastos (o péptido de tránsito al cloroplasto, "CTP") derivada de un organismo de algas conectada operablemente a la secuencia de nucleótidos de interés.

Por consiguiente, la presente invención proporciona una célula vegetal monocotiledónea que tiene incorporado de manera estable en su genoma un casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido dirigido al cloroplasto (CTP) , en donde dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicho CTP está conectada operablemente a una secuencia de nucleótidos de interés, y en donde dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicho CTP se selecciona del grupo que consiste en: a) la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 6; b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 6, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un péptido de tránsito al cloroplasto; c) una 45 secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 7; y, d) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 7, en donde dicha secuencia de aminoácidos es un péptido de tránsito al cloroplasto.

Los constructos de expresión son útiles para la expresión y el correcto direccionamiento de la secuencia de 50 nucleótidos de interés en una planta monocotiledónea. También se mencionan los vectores que comprenden los casetes de expresión, y las plantas y células de plantas que tienen incorporado establemente o expresado transitoriamente en sus genomas un casete de expresión ha descrito anteriormente. Adicionalmente, las composiciones incluyen semillas transgénicas de tales plantas.

Por lo tanto la invención proporciona adicionalmente:

 una planta que comprende la célula vegetal monocotiledónea de la invención; y  una semilla derivada de tal planta en donde la semilla comprende la secuencia de nucleótidos que codifica dicho péptido de tránsito al cloroplasto.

También se proporcionan métodos para la expresión de una secuencia de nucleótidos en una planta o célula vegetal, así como métodos para identificar secuencias de CTP de algas para uso en una planta. En particular, la invención proporciona un método para expresar una secuencia de nucleótidos de interés en una planta monocotiledónea, comprendiendo dicho método:

a) introducir en una célula vegetal un casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido dirigido al cloroplasto (CTP) , en donde dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicho CTP está conectada operablemente a dicha secuencia de nucleótidos de interés, y en donde dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicho CTP se selecciona del grupo que consiste en i) la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 6; ii) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 6, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un péptido de tránsito al cloroplasto; iii) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 7; y, iv) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 7, en donde dicha secuencia de aminoácidos es un péptido de tránsito al cloroplasto; y, b) regenerar una planta transformada a partir de dicha célula vegetal; en donde dicha planta ha incorporado de forma estable en su genoma dicho casete de expresión.

Descripción de las figuras La Figura 1 demuestra la expresión de TagGFP en protoplastos de tabaco.

La Figura 2 demuestra la expresión y el procesamiento del péptido de tránsito al cloroplasto de EPSPS de Chlamydomonas en células de maíz. Calle 1: Línea Hi-II de maíz no transgénico; Calles 2-6: Eventos To individuales transformados con el constructo de CTP de EPSPS de Chlamydomonas/GRG23 (ace3) (R173K) ; Calle 7: Marcador de peso molecular de proteína; Calle 8: Proteína GRG23 (ace3) (R173K) purificada (4 ng) .

La Figura 3 demuestra el cálculo del peso molecular de la proteína EPSPS de Chlamydomonas - GRG23 (ace3) (R173K) procesada expresada en el maíz.

Se utilizó una regresión lineal de la representación gráfica del Log del Peso molecular vs Distancia de Migración de los patrones de peso molecular de las proteínas de la Figura 2 para calcular el peso molecular aparente del patrón de proteína GRG23 (ace3) (R173K) y EPSPS de Chlamydomonas -GRG-23 (ace3) (R173K) procesada detectada en extractos de plantas.

Descripción detallada [0011] En la producción de plantas transgénicas es a menudo útil dirigir proteínas foráneas a localizaciones subcelulares específicas, por ejemplo, el cloroplasto, la vacuola, la mitocondria, o el RE. Trabajadores previos han fusionado secuencias de ADN que codifican péptidos de tránsito de varios genes de plantas a genes de interés. Cuando se traduce el gen la proteína resultante tiene el péptido de tránsito de planta fusionado al extremo amino terminal de la proteína de interés, y por lo tanto la proteína se dirige, con diferente eficacia, al compartimiento subcelular deseado.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a composiciones y métodos para la dirigir al cloroplasto polipéptidos en plantas monocotiledóneas superiores o células de plantas monocotiledóneas. Las composiciones comprenden casetes de expresión que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de tránsito al cloroplasto (CTP) derivado de un organismo de algas conectada operablemente a una secuencia de nucleótidos de interés, donde el CTP se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 6; b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 6, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un péptido de tránsito al cloroplasto; c) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 7; y, d) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 7, en donde dicha secuencia de aminoácidos es un péptido de tránsito... [Seguir leyendo]

1. Una célula vegetal monocotiledónea que tiene incorporado establemente en su genoma un casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido dirigido al cloroplasto (CTP) , en donde dicha 5 secuencia de nucleótidos que codifica dicho CTP está conectada operablemente a una secuencia de nucleótidos de interés, y en donde dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicho CTP se selecciona del grupo que consiste en: a) la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 6; b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 6, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un péptido de tránsito al cloroplasto;

c) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 7; y, d) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 7, en donde dicha secuencia de aminoácidos es un péptido de tránsito al cloroplasto.

2. Una planta que comprende la célula vegetal monocotiledónea de la reivindicación 1.

3. Una semilla derivada de la planta de la reivindicación 2, en donde dicha semilla comprende la secuencia de nucleótidos que codifica dicho péptido de tránsito al cloroplasto.

4. La célula vegetal monocotiledónea de la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleótidos de interés codifica un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, agentes patógenos, o insectos.

5. Un método para expresar una secuencia de nucleótidos de interés en una planta monocotiledónea, comprendiendo dicho método:

a) introducir en una célula vegetal un casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido dirigido al cloroplasto (CTP) , en donde dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicho CTP está conectada operablemente a dicha secuencia de nucleótidos de interés, y en donde dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicho CTP se selecciona del grupo que consiste en i) la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 6;

ii) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 6, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un péptido de tránsito al cloroplasto; iii) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 7; y, iv) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 7, en donde dicha secuencia de aminoácidos es un péptido de tránsito al cloroplasto; y, b) regenerar una planta transformada a partir de dicha célula vegetal; en donde dicha planta ha incorporado de forma estable en su genoma dicho casete de expresión.

6. El método de la reivindicación 5, en donde dicha secuencia de nucleótidos de interés codifica un producto génico 40 que confiere resistencia a herbicidas o plagas.