GRG23 EPSP SINTASAS MEJORADAS: COMPOSICIONES Y MÉTODOS DE USO.

Una molécula de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de:

a) una molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34; y, b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 29, 31, 33, ó 35

Campo de la invención

Esta invención se relaciona con biología molecular de plantas, particularmente con nuevos polipéptidos de EPSP sintasa que confieren una resistencia o tolerancia mejoradas al herbicida glifosato.

Antecedentes de la invención

N-fosfonometilglicina, comúnmente denominada como glifosato, en un importante producto químico agronómico. El glifosato inhibe la enzima que convierte al ácido fosfoenolpirúvico (PEP) y al ácido 3-fosfoshiquímico (S3P) en ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico. La inhibición de esta enzima (5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa, denominada aquí como "EPSP sintasa", o "EPSPS") mata células vegetales cerrando la ruta de shiquimato, inhibiendo por lo tanto la biosíntesis de aminoácidos aromáticos.

Ya que los herbicidas de la clase del glifosato inhiben la biosíntesis de aminoácidos aromáticos, ellos no solamente matan células vegetales, sino que también son tóxicos para células bacterianas. El glifosato inhibe muchas EPSP sintasas bacterianas, y por lo tanto es tóxico para estas bacterias. Sin embargo, ciertas EPSP sintasas bacterianas tienen una gran tolerancia al glifosato.

Las células de plantas resistentes a la toxicidad del glifosato pueden ser producidas por medio de la transformación de las células vegetales para expresar EPSP sintasas bacterianas resistentes al glifosato. Notablemente, el gen bacteriano de la cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens ha sido utilizado para conferir resistencia bactericida a células vegetales después de la expresión en plantas. Una EPSP sintasa mutada de la cepa CT7 de Salmonella typhimurium confiere resistencia al glifosato en células bacterianas, y confiere resistencia al glifosato sobre células vegetales (Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.535.060; 4.769.061; y 5.094.945).

La Patente de los Estados Unidos No. 6.040.497 reporta enzimas mutantes de EPSP sintasa del maíz que tienen sustituciones de treonina por isoleucina en la posición 102 y de prolina por serina en la posición 106 (la mutación "TIPS"). Tales alteraciones confieren resistencia al glifosato sobre la enzima del maíz. Un EPSP sintasa mutada de la cepa CT7 de Salmonella typhimurium confiere resistencia al glifosato en células bacterianas, y se reporta que confiere resistencia al glifosato sobre células vegetales (Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.535.060; 4.769.061; y 5.094.945). He et al. ((2001) Biochim et Biophysica Acta 1568: 1 - 6) han desarrollado EPSP sintasas con mayor tolerancia al glifosato por medio de mutagénesis y recombinación entre los genes para la EPSP sintasa de E. coli y de Salmonella typhimurium, y sugiere que mutaciones en la posición 42 (T42M) y en la posición 230 (Q230K) son probablemente las responsables por la resistencia observada. El siguiente trabajo (He et al. (2003) Biosci. Biotech. Biochem. 67: 1405 - 1409) muestra que la mutación T42M (treonina por metionina) es suficiente para mejorar la tolerancia tanto de la enzima de E. coli como de la enzima de Salmonella typhimurium. Debido a las muchas ventajas que proporcionan a las plantas la resistencia a los herbicidas, son deseables genes de resistencia a los herbicidas con actividad mejorada de resistencia al glifosato.

Un método alternativo para mutagénesis es el método de "mutagénesis permutacional" descrito en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 60/813.095, presentada el 13 de junio de 2006.

Resumen de la invención

Se proporcionan composiciones y métodos para conferir resistencia o tolerancia a los herbicidas. Las composiciones incluyen enzimas EPSP sintasas que son resistentes al herbicida glifosato, y moléculas de ácido nucleico que codifican tales enzimas, vectores que contienen aquellas moléculas de ácido nucleico, y células huésped que contienen los vectores. Las composiciones incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de resistencia a los herbicidas, incluidas aquellas que codifican polipéptidos que comprenden las SEQ ID NOs: 29, 31, 33, ó 35, así como las secuencias de polinucleótidos de las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34.

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Por lo tanto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de:

a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34; y, b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 29, 31, 33, ó 35.

Las secuencias de codificación pueden ser utilizadas en construcciones de ADN o casetes de expresión para transformación y expresión en organismos, incluidos microorganismos y plantas. Las composiciones también incluyen bacterias, plantas, células de plantas, tejidos, y semillas transformadas que son resistentes al glifosato por medio de la introducción de las composiciones de la invención en el genoma de los organismos. Donde el organismo es una planta, la introducción de la secuencia permite que herbicidas que contienen glifosato sean aplicados a plantas para matar selectivamente malas hierbas sensibles al glifosato u otras plantas no transformadas, pero no el organismo trasformado. Las secuencias pueden ser usadas adicionalmente como marcadoras para selección de células de plantas que crecen bajo condiciones de glifosato.

Se proporcionan adicionalmente métodos para identificar una enzima EPSP sintasa con actividad de resistencia al glifosato. Los métodos comprenden la identificación de secuencias adicionales de EPSP sintasa que son resistentes al glifosato con base en la presencia del dominio de la invención.

La presente invención también provee:

- un vector que contiene la molécula de ácido nucleico de la invención, preferiblemente que contiene además una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo;

- una célula huésped que contiene la molécula de ácido nucleico de la invención, preferiblemente que sea una célula huésped bacteriana o una célula de una planta;

- una planta transgénica que contiene la célula huésped de la planta de la invención, preferiblemente en donde se selecciona dicha planta del grupo que consiste de maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, y colza de semillas oleaginosas; y

- una semilla transgénica que contiene la molécula de ácido nucleico de la invención.

Adicionalmente, la invención proporciona un polipéptido recombinante seleccionado del grupo que consiste de:

a) un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 29, 31, 33, ó 35; y, b) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34, preferiblemente que contiene además una secuencia heteróloga de aminoácidos.

La invención provee además un método para conferir resistencia a un herbicida en una planta, comprendiendo dicho método la transformación de dicha plante con una construcción de ADN, conteniendo dicha construcción un promotor que dirige la expresión en una célula de una planta operativamente enlazada con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34, y regenerar una planta transformada, preferiblemente en donde dicho herbicida es glifosato.

La invención provee además una planta que tiene incorporado en forma estable en su genoma una construcción de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene actividad de resistencia a herbicidas, en donde dicha secuencia de nucleótidos es seleccionada del grupo que consiste de:

a) una molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34; y, b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 29, 31, 33, ó 35; en donde dicha secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión de una secuencia de codificación en una célula de una planta.

Adicionalmente, la invención provee un método para incrementar el vigor o la productividad en una planta que comprende:

a) proveer una planta que contiene la secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34; b) poner en contacto dicha planta con una concentración efectiva de... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de:

a) una molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34; y, b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 29, 31, 33, ó 35.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde dicha secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un promotor capaz de dirigir la expresión de una secuencia de codificación en una célula de una planta.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 ó 2, en donde dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia sintética que ha sido diseñada para expresión en una planta.

4. Un vector que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, 2, ó 3, preferiblemente que contiene adicionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo.

5. Una célula huésped que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2 ó 3, preferiblemente que es una célula huésped bacteriana o una célula de una planta.

6. Una planta transgénica que contiene la célula huésped de la planta de la reivindicación 5, preferiblemente en donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste de maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, y colza de semillas oleaginosas.

7. Una semilla transgénica que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, 2, ó 3.

8. Un polipéptido recombinante seleccionado del grupo que consiste de:

a) un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 29, 31, 33, ó 35; y, b) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 28, 30, 32, ó 34, preferiblemente que contiene adicionalmente una secuencia heteróloga de aminoácidos.

9. Un método para producir un polipéptido con actividad de resistencia a los herbicidas, que comprende el cultivo de las célula huésped de la reivindicación 5 bajo condiciones en las cuales se expresa una molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido, siendo dicho polipéptido seleccionado del grupo que consiste de:

a) un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 29, 31, 33, ó 35; y, b) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34.

10. Un método para conferir resistencia a un herbicida en una planta, comprendiendo dicho método la transformación de dicha planta con una construcción de ADN, comprendiendo dicha construcción un promotor que dirige la expresión en una célula de una planta operativamente enlazada con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34, y la regeneración de una planta transformada, preferiblemente en donde dicho herbicida es glifosato.

11. Una planta que tiene incorporada en forma estable dentro de su genoma una construcción de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene actividad de resistencia los herbicidas, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste de:

a) una molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34; y, b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 29, 31, 33, ó 35; en donde dicha secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión de una secuencia de codificación en una célula de una planta.

12. La planta de la reivindicación 11, en donde dicha planta es una célula de una planta, una planta de soja, o una planta de maíz.

13. La planta de la reivindicación 11, en donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste de maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, y colza de semillas oleaginosas.

14. Un método para incrementar el vigor o la productividad en una planta que comprende un producto: a) proveer una planta que contiene la secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34; b) poner en contacto dicha planta con una concentración efectiva de glifosato; y, c) cultivar dicha planta bajo condiciones en donde la temperatura es más alta que la temperatura del medio ambiente al menos durante dos horas consecutivas por día durante al menos cuatro días después del contacto con dicho glifosato, en donde dichos días después el contacto están dentro del período vegetativo de la planta,

en donde el vigor o la productividad de dicha planta son mayores al vigor o a la productividad de una planta que expresa una EPSP sintasa de tolerancia al glifosato que no tiene una temperatura óptima más alta que la temperatura del medio ambiente, preferiblemente en donde la temperatura en la etapa (c) es aproximadamente de 32°C hasta aproximadamente 60°C.

15. Un método para conferir resistencia al glifosato en una planta que comprende:

a) proveer una planta que contiene la secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOs: 28, 30, 32, ó 34; b) poner en contacto dicha planta con una concentración efectiva de glifosato; y, c) cultivar dicha planta bajo condiciones en donde la temperatura es más alta que la temperatura del medio ambiente al menos durante dos horas consecutivas por día durante al menos cuatro días después el contacto con dicho glifosato, en donde dichos días después el contacto están dentro del período vegetativo de la planta.

16. El método de la reivindicación 14, en donde la temperatura en la etapa (c) es aproximadamente de 32°C hasta aproximadamente 60°C, preferiblemente en donde la temperatura en la etapa (b) es aproximadamente de 37°C.