Exotoxina A de Pseudomonas mejorada con inmunogenicidad reducida.

Una exotoxina A de Pseudomonas ("PE") aislada, en donde dicha PE tiene los restos 1-273 y 285-394 eliminados y sustituciones de alanina,

glicina o serina en lugar de los restos de aminoácidos D406 y Q592 correspondientes a un resto de aminoácido de la SEC ID Nº 1.

Exotoxina A de Pseudomonas mejorada con ¡nmunogenicidad reducida Campo de ¡a invención

La presente invención proporciona moléculas mejoradas de Exotoxina A de Pseudomonas (PE) con alta citotoxicidad e ¡nmunogenicidad reducida, composiciones que contienen la (PE) mejorada, y métodos de uso.

Antecedentes de ia invención

En los últimos años se han desarrollado inmunoconjugados como enfoque terapéutico alternativo para tratar neoplasias. Los Inmunoconjugados se componían originalmente de un anticuerpo químicamente conjugado con una toxina vegetal o bacteriana, una forma que es conocida como ¡nmunotoxina. El anticuerpo se une al antígeno expresado en la célula diana y la toxina se internaliza causando muerte celular deteniendo la síntesis de proteínas e Induciendo apoptosis (Brlnkmann, LL, Mol. Med. Today, 2:439-446 (1996)). Más recientemente, se han fusionado genes que codifican el anticuerpo y la toxina y se ha expresado la ¡nmunotoxina como una proteína de fusión.

Se han realizado varios estudios sobre inmunotoxinas que usan como resto tóxico una toxina bacteriana conocida como exotoxina A de Pseudomonas ("PE"). Normalmente, la PE se ha truncado o mutado para reducir su toxicidad no específica sin destruir su toxicidad hacia las células a las que está dirigida mediante la parte de direccionamiento de la ¡nmunotoxina. Actualmente hay varios ensayos clínicos en curso ensayando el uso de inmunotoxinas basadas en PE como tratamientos para diversos cánceres.

El documento W02007016150; el documento W02009032954; Onda ef a/, Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America, vol. 105, n- 32, agosto de 2008, páginas 11311-11316; Onda ef a/, Journal of Immunology, vol. 177, n- 12, 1 de diciembre de 2006, páginas 8822-8834; y Hansen ef a/, Journal of Immunotherapy, vol. 33, n- 3, abril de 2010 (2010-04), páginas 297-304 describen moléculas de PE.

Las actuales Inmunotoxinas basadas en PE son altamente inmunogénicas. Esto ha demostrado ser un problema en el tratamiento de neoplasias hematológicas, en que a menudo se ve comprometida la capacidad del sistema inmune para montar una respuesta. Las Inmunotoxinas normalmente pueden administrarse múltiples veces a pacientes con neoplasias hematológicas. Los pacientes con tumores sólidos, sin embargo, habitualmente desarrollan anticuerpos neutralizantes contra Inmunotoxinas basadas en PE semanas después de la primera administración. Como muchos protocolos exigen un periodo de tres semanas entre la administración de inmunotoxinas, el desarrollo de los anticuerpos durante este periodo efectivamente significa que, para tumores sólidos, habitualmente puede hacerse una única administración de una ¡nmunotoxina basada en PE antes de que los anticuerpos del paciente la vuelvan Ineficaz. Incluso una única administración de una ¡nmunotoxina basada en PE puede ser muy útil para reducir la carga tumoral del paciente, en la eliminación de metástasis más pequeñas, y en el alivio de los síntomas. No obstante, sería deseable tener formas menos antigénicas de inmunotoxinas basadas en PE que redujeran las respuestas Inmunogénicas del paciente.

La presente Invención satisface estas y otras necesidades.

Breve sumario de la invención

La presente invención se refiere a exotoxina A de Pseudomonas ("PE") mejorada con ¡nmunogenicidad reducida. Estructuralmente, la PE mejorada tiene eliminado el Dominio I, eliminada la mayoría del Dominio II, y sustituciones en las posiciones de restos de aminoácido del Dominio III D406 y Q592 con una glicina, alanina o señna.

Funcionalmente, las moléculas de PE mejorada a las cuales se refiere la invención retienen alta actividad citotóxica con la eliminación de epítopos de células B. Ratones que reciben 5 inyecciones de la presente PE mejorada no desarrollaron una respuesta inmune contra la toxina. Las moléculas de PE mejorada se ejemplifican por una realización particular de la invención mencionada aquí como LR-8M (previamente mencionada como LR-8X).

Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona una endotoxina A de Pseudomonas ("PE") aislada, donde dicha PE tiene los restos 1-273 y 285-394 eliminados y sustituciones de alanina, glicina o señna en lugar de los restos de aminoácido D406 y Q592 correspondientes a un resto de aminoácido de la SEC ID N-1.

En una realización, la PE tiene adicionalmente una sustitución de alanina, glicina o señna de al menos un resto de aminoácido correspondiente a un resto de aminoácido de la SEC ID N- 1 seleccionado entre el grupo que consiste en R432, R467, R490, R513, R548, K590.

En otro aspecto, la invención proporciona una molécula quimérica que comprende (a) un resto de direccionamiento conjugado o fusionado a la exotoxina A de Pseudomonas ("PE") de la invención.

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

También se describen en este documento moléculas quiméricas que comprenden (a) un resto de direccionamiento conjugado o fusionado con (b) una exotoxina A de Pseuc/omonas ("PE"), donde dicha PE tiene los restos 1-273 y 285-394 eliminados y sustituciones de alanina, glicina o serina en lugar de los restos de aminoácido D406, R432, R467, R490, R513, E548, K590 y Q592 correspondientes a un resto de aminoácido de la SEC ID N-1.

También se describen en este documento composiciones que comprenden

(a) una molécula quimérica que comprende un resto de direccionamiento conjugado o fusionado a una exotoxina A de Pseuc/omonas ("PE"), donde dicha PE tiene los restos 1-273 y 285-394 eliminados y sustituciones de alanina, glicina o serina en lugar de los restos de aminoácido D406, R432, R467, R490, R513, E548, K590 y Q592 correspondientes a un resto de aminoácido de la SEC ID N-1, y

(b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

También se describen en este documento ácidos nucleicos aislados que codifican una exotoxina A de Pseudomonas ("PE") modificada, donde dicha PE tiene los restos 1-273 y 285-394 eliminados y sustituciones de alanina, glicina o serina en lugar de los restos de aminoácido D406, R432, R467, R490, R513, E548, K590 y Q592 correspondientes a un resto de aminoácido de la SEC ID N- 1. En algunas realizaciones, el ácido nucleico codifica adicionalmente un resto de direccionamiento.

También se describen en este documento métodos para inhibir el crecimiento de una célula que alberga una molécula diana, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula con una molécula quimérica que comprende

(a) un resto de direccionamiento que se une específicamente a dicha molécula diana, y

(b) una exotoxina A de Pseudomonas ("PE"), donde dicha PE tiene los restos 1-273 y 285-394 eliminados y sustituciones de alanina, glicina o serina en lugar de los restos de aminoácido D406, R432, R467, R490, R513, E548, K590 y Q592 correspondientes a un resto de aminoácido de la SEC ID N-1,

donde el contacto de dicha célula con dicha molécula quimérica inhibe el crecimiento de dicha célula.

Con respecto a las realizaciones, en algunas realizaciones, la PE contiene también opcionalmente una sustitución de alanina, glicina o serina de al menos un resto de aminoácido correspondiente a un resto de aminoácido de la SEC ID N-1 seleccionado entre el grupo que consiste en D403, R412, R427, E431, R458, D461, R505, E522, R538, R551, R576y L597.

En algunas realizaciones, la PE tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID N- 2. En algunas realizaciones, la PE tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID N- 3.

En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento es un anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo se selecciona entre el grupo que consiste en un scFv, un dsFv, un Fab, un anticuerpo de un solo dominio y un F(ab')2.

En algunas realizaciones, el anticuerpo es contra un antígeno de superficie celular seleccionado entre el grupo que consiste en CD19, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD79b, receptor de transferrina, receptor de EGF, mesotelina, cadherina y Lewis Y.

En algunas realizaciones, el anticuerpo se selecciona entre el grupo que consiste en B3, RFB4, SS1, HN1, HN2, MN y HB21.

En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene una cadena ligera variable (VL) que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR), y una cadena pesada variable (VFI) que comprende tres CDR, donde

(i) dicha CDR1 de VL tiene la secuencia QDIXXY, donde XX se selecciona entre SN, HG, GR, RG y AR;

(¡i) dicha VL CDR2 tiene la secuencia YTS;

(iii) dicha VL CDR3 tiene la secuencia QQGNTLPWT;

(¡v) dicha VFI CDR1 tiene la secuencia GFAFSIYD;

(v) dicha VFI CDR2 tiene la secuencia ISSGGGTT;

(vi) dicha VFI CDR3 tiene la secuencia... [Seguir leyendo]

1. Una exotoxina A de Pseuc/omonas ("PE") aislada, en donde dicha PE tiene los restos 1-273 y 285-394 eliminados y sustituciones de alanina, glicina o serina en lugar de los restos de aminoácidos D406 y Q592 correspondientes a un resto de aminoácido de la SEC ID N-1.

2. La PE de la reivindicación 1, en donde dicha PE tiene adicionalmente una sustitución de alanina, glicina o serina de al menos un resto de aminoácido correspondiente a un resto de aminoácido de la SEC ID N- 1 seleccionado entre el grupo que consiste en R432, R467, R490, R513, E548, K590.

3. La PE de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en donde dicha PE tiene adicionalmente una sustitución de alanina, glicina o serina de al menos un resto de aminoácido correspondiente a un resto de aminoácido de la SEC ID N- 1 seleccionado entre el grupo que consiste en D403, R412, R427, E431, R458, D461, R505, E522, R538, R551, R576 y L597.

4. La PE de la reivindicación 1, en donde dicha PE tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID hP 2.

5. La PE de la reivindicación 4, en donde dicha PE tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID l\P 3.

6. Una molécula quimérica que comprende (a) un resto de direccionamiento conjugado o fusionado con la exotoxina A de Pseuc/omonas ("PE") de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. La molécula quimérica de la reivindicación 6, en donde dicho resto de direccionamiento es un anticuerpo, citoquina, una linfoquina o un factor de crecimiento.

8. La molécula quimérica de la reivindicación 7, en donde el anticuerpo se selecciona entre el grupo que consiste en un scFv, un dsFv, un Fab, un anticuerpo de un único dominio y un F(ab')2.

9. La molécula quimérica de la reivindicación 7, en donde dicho anticuerpo es contra un antígeno de superficie celular seleccionado entre el grupo que consiste en CD19, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD79b, receptor de transferrina, receptor de EGF, mesotelina, cadherinay Lewis Y.

10. La molécula quimérica de la reivindicación 7, en donde dicho anticuerpo se selecciona entre el grupo que consiste en B3, RFB4, SS1, MN, HN1, HN2 y HB21.

11. La molécula quimérica de la reivindicación 7, en donde dicho anticuerpo tiene una cadena ligera variable (VL) que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) y una cadena pesada variable (VH) que comprende tres CDR, en donde

(i) dicha CDR1 de VL tiene la secuencia QDIXXY, en la que XX se selecciona entre SN, HG, GR, RG y AR;

(¡i) dicha CDR2 de VL tiene la secuencia YTS;

(iii) dicha CDR3 de VL tiene la secuencia QQGNTLPWT;

(iv) dicha CDR1 de VH tiene la secuencia GFAFSIYD;

(v) dicha CDR2 de VH tiene la secuencia ISSGGGTT;

(vi) dicha CDR3 de VH tiene la secuencia ARHSGYGXXXGVLFAY, en la que XXX se selecciona entre SSY, THW, YNW, TTW y STY.

12. La molécula quimérica de la reivindicación 11, en donde dicho anticuerpo tiene una cadena ligera variable (VL) que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) y una cadena pesada variable (VH) que comprende tres CDR, en donde

(i) dicha CDR1 de VL tiene la secuencia QDIHGY;

(¡i) dicha CDR2 de VL tiene la secuencia YTS;

(iii) dicha CDR3 de VL tiene la secuencia QQGNTLPWT;

(iv) dicha CDR1 de VH tiene la secuencia GFAFSIYD;

(v) dicha CDR2 de VH tiene la secuencia ISSGGGTT;

(vi) dicha CDR3 de VH tiene la secuencia ARHSGYGTHWGVLFAY.

13. Una composición farmacéutica que comprende la molécula quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Un ácido nucleico aislado que codifica la PE de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o la molécula quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12.

15. La composición farmacéutica de la reivindicación 13 para su uso en un método para inhibir el crecimiento indeseado o la proliferación de una célula que expresa uno o más marcadores de superficie celular en un sujeto.

16. Una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el sujeto tiene leucemia linfática crónica.