Métodos para determinar el subtipo de un carcinoma hepatocelular.

Un método para determinar el subtipo de un carcinoma hepatocelular (CHC) en un sujeto,

que comprende:

a) obtener una muestra de tejido hepático de un sujeto que tiene un subtipo de CHC, seleccionado de uno o más de: carcinoma hepatocelular del tipo epitelio del conducto biliar (BDE-CHC); carcinoma hepatocelular del tipo células madre hepáticas (HSC-CHC); carcinoma hepatocelular del tipo de progenitores hepatocíticos (HP-CHC);

y, carcinoma hepatocelular del tipo de hepatocitos maduros (MH-CHC);

b) llevar a cabo un análisis de laboratorio de la muestra para determinar la expresión de uno o más de los biomarcadores de la familia de biomarcadores miR-181 en la muestra,

c) correlacionar la expresión de uno o más biomarcadores de la familia de miR-181 en la muestra con el subtipo de CHC en el sujeto, y

d) determinar el subtipo del CHC en la muestra a partir de la correlación, en donde;

i) la sobreexpresión de uno o más de miR-181a-1 y miR-181a-2, en comparación con los niveles de expresión en tejido no tumoral, es indicativa de carcinoma hepatocelular del tipo epitelio de conducto biliar (BDE-CHC);

ii) la sobreexpresión de uno o más de miR-181b-1 y miR-181b-2, y la ausencia o infraexpresión de uno o más de miR-181a-1 y miR-181a-2, en comparación con los niveles de expresión en tejido no tumoral, es indicativa de carcinoma hepatocelular del tipo de células madre hepáticas (HSC-CHC);

iii) la infraexpresión de uno o más de miR-181a-2, miR-181b-1 y miR-181b-2, en comparación con los niveles de expresión en tejido no tumoral, y la ausencia de sobreexpresión e infraexpresión de miR-181a1, en comparación con los niveles de expresión en tejido no tumoral, es indicativa de carcinoma hepatocelular del tipo de progenitores hepatocíticos (HP-CHC); y

iv) la infraexpresión de miR-181a-1, en comparación con los niveles de expresión en tejido no tumoral, es indicativa de carcinoma hepatocelular del tipo de hepatocitos maduros (MH-CHC).

Métodos para determinar el subtipo de un carcinoma hepatocelular

Antecedentes de la invención El carcinoma hepatocelular (CHC) es la tercera causa más importante de muerte por cáncer alrededor del mundo. El CHC es muy heterogéneo en términos de su presentación clínica y patrones genómicos y transcriptómicos. La heterogeneidad en CHC y la falta de biomarcadores apropiados para su detección e identificación de subtipo han obstaculizado el pronóstico de los pacientes y la estratificación del tratamiento.

Por consiguiente, existe un deseo de uno o más biomarcadores que puedan identificar el subtipo de CHC en un mamífero, así como de métodos para proporcionar un tratamiento apropiado basándose en el subtipo de CHC. MURAKAMI Y et al: "Comprehensive analysis of microRNA expression patterns in hepatocellular carcinoma and non

tumorous tissues", Oncogene, nature Publishing group, RU Vol. 25, Nº. 17, 1 de Abril de 2006, páginas 2537-2545 se refiere a la identificación de marcadores biológicos para una "mejor detección del CHC" En este estudio se examinaron las expresiones de los miARN en especímenes de CHC en comparación con los especímenes no tumorales adyacentes, y se descubrieron 30 genes de miARN que se expresaron de forma significativamente diferencial en el CHC y los tejidos no tumorales correspondientes.

Breve sumario de la invención La presente divulgación proporciona un método para determinar el subtipo de CHC en el sujeto, comprendiendo el método a) obtener una muestra del sujeto, b) ensayar la muestra para detectar al menos 1 biomarcador y c) 25 correlacionar los biomarcadores detectados con un subtipo de CHC en el sujeto. A este respecto, los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en los biomarcadores identificados por las SEC ID Nº: 1-39.

La presente divulgación también proporciona un método de detección de una célula madre de CHC en una muestra. En una realización el método de la invención comprende a) obtener una muestra, b) ensayar la muestra para detectar la presencia de un biomarcador mir-181, y c) correlacionar la presencia o ausencia del biomarcador mir-181 con la presencia o ausencia de la célula madre de CHC en la muestra.

La presente divulgación también proporciona métodos y composiciones para tratar a sujetos con CHC que aprovechan los biomarcadores asociados con células madre de CHC. 35

Breve descripción de las distintas vistas de las figuras La Figura 1A muestra la expresión de mir-181a1 en una relación log (2) (de tejido tumoral respecto a no tumoral) en células HSC-CHC basándose en el análisis de micro ARN.

La Figura 1B muestra la expresión de mir-181a2 en una relación log (2) (de tejido tumoral respecto a no tumoral) en células de HSC, DBE, HP, y MH-CHC basándose en el análisis de micro ARN.

La Figura 1C muestra la expresión de mir-181b1 en una relación log (2) (de tejido tumoral respecto a no tumoral) en células HSC, DBE, HP, y MH-CHC basándose en el análisis de micro ARN.

La Figura 1D muestra la expresión de mir-181b2 en una relación log (2) (de tejido tumoral respecto a no tumoral)

en células HSC, DBE, HP, y MH-CHC basándose en el análisis de micro ARN. La Figura 1E muestra la expresión de mir-181c en una relación log (2) (de tejido tumoral respecto a no tumoral) en células HSC, DBE, HP, y MH-HCC basándose en el análisis de micro ARN. La Figura 1F muestra la expresión de mir-181a en una relación log (2) (de tejido tumoral respecto a no tumoral) en células HSC, DBE, HP, y MH-HCC como se determina por RT-PCR. La Figura 1G muestra la expresión de mir-181b en una relación log (2) (de tejido tumoral respecto a no tumoral) en células HSC, DBE, HP, y MH-CHC como se determina por RT-PCR. La Figura 1H muestra la expresión de mir-181c en una relación log (2) (de tejido tumoral respecto a no tumoral) en células HSC, DBE, HP, y MH-CHC tal como se determina por RT-PCR. La Figura 1I muestra la expresión de mir-181d en una relación log (2) (de tejido tumoral respecto a no tumoral) en 55 células HSC, DBE, HP, y MH-CHC tal como se determina por RT-PCR. La Figura 1J muestra la expresión de mir-213 en una relación log (2) (de tejido tumoral respecto a no tumoral) en células HSC, DBE, HP, y MH-CHC tal como se determina por RT-PCR. La Figura 2A muestra una gráfica de dispersión de mir-181a1. La Figura 2B muestra una gráfica de dispersión de mir-181a2. La Figura 2C muestra una gráfica de dispersión de mir-181b1. La Figura 2D muestra una gráfica de dispersión de mir-181b2. La Figura 2E muestra una gráfica de dispersión de mir-181 c. La Figura 3A una gráfica que muestra la multiplicidad de producción de mir-181a, mir-181b, mir-181c y mir-181d a 0, 2 y 8 días en medio ESC frente a cultivo regular.

La Figura 3B es una gráfica que muestra la multiplicidad de CAR y UGT2B7 a 0, 2 y 8 días en medio ESC frente a cultivo regular.

La Figura 3C es una gráfica que muestra la multiplicidad de producción de CCND1 y TACSTD1 a 0, 2 y 8 días en medio ESC frente a cultivo regular.

La Figura 3D es una gráfica que muestra la multiplicidad de producción de mir-181a, mir-181b, mir-181c y mir181d a 0, 1, 2 y 8 días después de la retirada del medio ESC.

La Figura 3E es una gráfica que muestra la multiplicidad de producción de CAR y UGT2B7 a 0, 1, 2 y 8 días después de la retirada del medio ESC. La Figura 3F es una gráfica que muestra la multiplicidad de producción de CCND1 y TCSTD1 a 0, 1, 2 y 8 días después de la retirada del medio ESC. La Figura 4 es una gráfica de la expresión relativa de mir-181b en células HuH1 tratadas con pMSCV-hTR y pMSCV-mir-181b1. La Figura 5 es una gráfica de la expresión relativa de mir-181s en células HuH7 transfectadas con antisentido 2’O-metil frente a control. La Figura 6A es una gráfica de la expresión relativa de CCND1 en células HuH1 tratadas con pMSCV-hTR y pMSCV-mir-181b1.

La Figura 6B es una gráfica de la expresión relativa de TACTD1 en células HuH1 tratadas con pMSCV-hTR y pMSCV-mir-181b1. La Figura 6C es una gráfica de la expresión relativa de DKK1 en células HuH1 tratadas con pMSCV-hTR y pMSCV-mir-181b1. La Figura 6D es una gráfica de la expresión relativa de CCND1 en células HuH7 tratadas con control y antisentido. La Figura 6E es una gráfica de la expresión relativa de TACSTD1 en células HuH7 tratadas con control y antisentido. La Figura 6F es una gráfica de la expresión relativa de DKK1 en células HuH7 tratadas con control y antisentido. La Figura 7A muestra los sitios de unión predichos de mir-181a, mir-181b, mir-181c y mir-181d al 3’-UTR 611

632 de DKK1. La Figura 7B muestra los sitios de unión predichos de mir-181a, mir-181b, mir-181c y mir-181d al 3’-UTR 771799 de DKK1. La Figura 8A es un sitio de unión predicho a TCF-4 para mir-181a1 y mir-181b1. La Figura 8B es un sitio de unión predicho a TCF-4 para mir-181a2 y mir-181b2. La Figura 8C es un sitio de unión predicho a TCF-4 para mir-181c y mir-181d. La Figura 8D es otro sitio de unión predicho a TCF-4 para mir-181c y mir-181d La Figura 9 es una gráfica de la multiplicidad de mir-181a, mir-181b, mir-181c, y mir-181d en cada línea celular (Hep3b tipo B (HSC-CHC) , MHCC97 tipo C (HP-CHC) , Smmc7721 tipo D (MH-CHC) ) frente a hepatocitos primarios.

La Figura 10 es una gráfica del número de miARN con expresión aumentada y disminuida en los subtipos HSC-CHC, BDE-CHC, HP-CHC y MH-CHC.

Descripción detallada de la invención Los micro ARN (o miARN) son productos génicos de ARN pequeños no codificantes (por ejemplo, ∼22 nt) que existen en numerosos organismos y desempeñan papeles reguladores importantes en la traducción del ARNm y la degradación mediante la formación de pares de bases con sitios parcialmente complementarios del ARNm, predominantemente en la región 3’ no traducida. Lee, Science, 294 (5543) :862-864 (2001) ; Lau, Science, 294 (5543) :858-862 (2001) ; Lagos, Science, 294 (5543) :853-858 (2001) . Los miARN se expresan como precursores 45 de ARN largos que se procesan por Drosha, una nucleasa celular, y posteriormente se transportan al citoplasma por un mecanismo dependiente de Exportina 5. Yi, Genes Dev, 17 (24) :3011-3016 (2003) ; Gregor y , Cancer Res., 65 (9) :3509-3512 (2005) . Después, la enzima DICER escinde los miARN, dando como resultado miARN de aproximadamente 17-24 nt que se asocian con un complejo de tipo silenciamiento inducido por ARN. Lee, EMBO J, 21 (17) :4663-4670 (2002) ; Hutvagner, Science, 297 (5589) :2056-2060 (2002) .

El estudio se basa en el hallazgo de que los biomarcadores de miARN se asocian con subtipos de CHC. Para los fines de la invención, los subtipos de CHC de la invención se refieren a CHC de tipo células madre hepáticas (HSC-CHC) , que... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar el subtipo de un carcinoma hepatocelular (CHC) en un sujeto, que comprende:

a) obtener una muestra de tejido hepático de un sujeto que tiene un subtipo de CHC, seleccionado de uno o más de: carcinoma hepatocelular del tipo epitelio del conducto biliar (BDE-CHC) ; carcinoma hepatocelular del tipo células madre hepáticas (HSC-CHC) ; carcinoma hepatocelular del tipo de progenitores hepatocíticos (HP-CHC) ; y, carcinoma hepatocelular del tipo de hepatocitos maduros (MH-CHC) ; b) llevar a cabo un análisis de laboratorio de la muestra para determinar la expresión de uno o más de los biomarcadores de la familia de biomarcadores miR-181 en la muestra, c) correlacionar la expresión de uno o más biomarcadores de la familia de miR-181 en la muestra con el subtipo de CHC en el sujeto, y d) determinar el subtipo del CHC en la muestra a partir de la correlación, en donde;

i) la sobreexpresión de uno o más de miR-181a-1 y miR-181a-2, en comparación con los niveles de expresión en tejido no tumoral, es indicativa de carcinoma hepatocelular del tipo epitelio de conducto biliar (BDE-CHC) ; ii) la sobreexpresión de uno o más de miR-181b-1 y miR-181b-2, y la ausencia o infraexpresión de uno o más de miR-181a-1 y miR-181a-2, en comparación con los niveles de expresión en tejido no tumoral, es indicativa de carcinoma hepatocelular del tipo de células madre hepáticas (HSC-CHC) ;

iii) la infraexpresión de uno o más de miR-181a-2, miR-181b-1 y miR-181b-2, en comparación con los niveles de expresión en tejido no tumoral, y la ausencia de sobreexpresión e infraexpresión de miR-181a1, en comparación con los niveles de expresión en tejido no tumoral, es indicativa de carcinoma hepatocelular del tipo de progenitores hepatocíticos (HP-CHC) ; y iv) la infraexpresión de miR-181a-1, en comparación con los niveles de expresión en tejido no tumoral, es indicativa de carcinoma hepatocelular del tipo de hepatocitos maduros (MH-CHC) .

2. El método de la reivindicación 1, que comprende uno o más de:

seleccionar la muestra de tejido del grupo que consiste en tejido tumoral de hígado, tejido de biopsia congelado,

tejido de biopsia incluido en parafina y combinaciones de los mismos; y analizar la muestra mediante uno o más métodos seleccionados del grupo que consiste en técnicas de micromatriz, amplificación por PCR, hibridación de ARN, hibridación in situ, electroforesis en gel y combinaciones de las mismas.

3. El método de la reivindicación 1, que además comprende determinar el subtipo de CHC en la muestra mediante:

la detección de la presencia de células madre molécula de adhesión de células epiteliales EpCAM+ alfa fetoproteína AFP+ en la muestra, y la correlación de la presencia de células madre EpCAM+ AFP+ con la presencia del subtipo HSC-CHC en la muestra, en donde la presencia de EpCAM+ AFP+ indica la presencia del HSC-CHC en la muestra.

4. El método de la reivindicación 1, que además comprende determinar el subtipo de CHC en la muestra mediante:

la detección de la presencia de células madre molécula de adhesión de células epiteliales EpCAM+ alfa 45 fetoproteína AFP-en la muestra, y la correlación de la presencia de células madre EpCAM+ AFP-con la presencia del subtipo BDE-CHC en la muestra, en donde la presencia de EpCAM+ AFP-indica la presencia del BDE-CHC en la muestra.

5. El método de la reivindicación 1, que además comprende determinar el subtipo de CHC en la muestra mediante:

la detección de la presencia de células madre molécula de adhesión de células epiteliales EpCAM-AFP+ en la muestra, y la correlación de la presencia de células madre EpCAM-AFP+ con la presencia del subtipo HP-CHC en la muestra, en donde la presencia de EpCAM-AFP+ indica la presencia del HP-CHC en la muestra.

6. El método de la reivindicación 1, que además comprende determinar el subtipo de CHC en la muestra mediante:

la detección de la presencia de células madre molécula de adhesión de células epiteliales EpCAM-alfa fetoproteína AFP-en la muestra, y la correlación de la presencia de células madre EpCAM-AFP-con la presencia del subtipo MH-CHC en la 60 muestra, en donde la presencia de EpCAM-AFP-indica la presencia del MH-CHC en la muestra.

7. El método de la reivindicación 3, que además comprende determinar el pronóstico del sujeto, en donde el subtipo HSC-CHC es indicativo de mal pronóstico.