Deleciones en el dominio II de la exotoxina A de pseudomonas que reducen la toxicidad inespecífica.

Una exotoxinaa A de Pseudomonas (PE) aislada, mutada que comprende una secuencia de la fórmula:

R1n-FCS-R2n-R3n-PE dominio III funcional, en donde:

n ≥ 0 o 1 independientemente para cada uno de R1, R2 y R3;

R1 ≥ 1 a 10 residuos de aminoácidos;

FCS ≥ una secuencia de escisión de furina de residuos de aminoácidos, la secuencia es escindible por furina y tiene un extremo aminoácido y un extremo carboxilo, en donde la FCS:

a) es representada por la fórmula P4-P3-P2-P1, en donde P4 es un residuo de aminoácido en el extremo amino, P1 es un residuo de aminoácido en el extremo carboxilo, P1 es una arginina o un residuo de lisina, y dicha secuencia es escindible en el extremo carboxilo de P1 por furina;

b) (i) adicionalmente comprende residuos de aminoácidos representados por P6-P5 en dicho extremo amino, (ii) adicionalmente comprende residuos de aminoácidos representados por P1'-P2' en dicho extremo carboxilo, (iii) en donde además P1 es una arginina o un residuo de lisina, P2' es triptófano, y P4 puede ser arginina, valina o lisina, siempre y cuando si P4 no es arginina, entonces P6 y P2 son residuos básicos, y (iv) dicha secuencia es escindible en el extremo carboxilo de P1por furina;

c) se selecciona de las sec. con núms. de ident.: 12-20;

d) es la sec. con núm. de ident.:, o una versión truncada de esta que comprende RQPR (sec. con núm. de ident.: 21); or e) es la sec. con núm. de ident.: 11, o una versión truncada de esta que comprende RSKR (sec. con núm. de ident.: 26); R2 ≥ 1 a 10 aminoácidos; y

R3 ≥ 1 o más residuos contiguos de los residuos 365-394 de sec. con núm. de ident.: 1;

el dominio III de PE funcional son los residuos 395-613 de la sec. con núm. de ident.: 1, que comprende opcionalmente (i) sustituciones en uno o más residuos que corresponden a 609-613 de la sec. con núm. de ident.: 1, (ii) una sustitución de glicina, alanina, valina, leucina, o isoleucina por arginina en una posición que corresponde a la posición 490 de la sec. con núm. de ident.: 1, (iii) una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina por uno o más residuos que corresponden a los residuos seleccionados de D403, R412, R427, E431, R432, R458, D461, R467, R505, R513, E522, R538, E548, R551, R576, K590, y L597 de la sec. con núm. de ident.: 1, donde los residuos de la sec. con núm. de ident.: 1 mantienen inmunogenicidad de un epítopo o subepitopo del dominio III de PE, o (iv) una combinación de cualquiera de (i) - (iii), en donde el PE mutado no incluye los residuos 1 a 273 y 285 a 364 de la sec. con núm. de ident.: 1.

Deleciones en el dominio 11 de la exotoxina A de pseudomonas que reducen la toxicidad inespecifica Antecedentes de la invención En los últimos años se han desarrollado inmunoconjugados como un enfoque terapéutico alternativo para el tratamiento de neoplasias malignas. Los inmunoconjugados estaban compuestos originalmente de un anticuerpo conjugado quimicamente a una toxina vegetal o una bacteriana, una forma que se conoce como una inmunotoxina. El anticuerpo se une al antigeno expresado sobre la célula objetivo y la toxina se internaliza lo que provoca la muerte celular al detener la síntesis de proteínas e inducir apoptosis (Brinkmann, U., Mol. Med. Today, 2:439-446 (1996) ) . Más recientemente, los genes que codifican el anticuerpo y la toxina se han fusionado y la inmunotoxina se expresa como una proteína de fusión Una variedad de toxinas de plantas, hongos y bacterias se han adaptado para usar con inmunotoxinas, que incluyen ricina, toxina de la difteria, y exotoxina A de Pseudomonas (PE) (Pastan, 1. y otros, Nat Rev Cancer, 6:559-565 (2006) ; Pastan, 1. y otros, Annu Rev Med, 58:221 -237 (2007) ) . Las inmunotoxinas basadas en PE están actualmente en ensayos clínicos para el tratamiento de linfomas y leucemias que expresan CD22, así como también tumores sólidos que expresan mesotelina (Kreitman, R., y otros, J Clin Oncol, 23:6719-6729 (2005) : Hassan, R., Clin Cancer Res, 13:5144-5149 (2007". Típicamente, la PE se ha truncado o mutado para reducir su toxicidad inespecífica mientras que conserva su toxicidad para las células a las que está dirigida por la porción de direccionamiento de la inmunotoxina. Con el paso de los años, se han desarrollado numerosas formas mutadas y truncadas de PE. La que se usa en la mayoría de los ensayos clínicos hasta la fecha es una forma truncada de 38 kD denominada como ·PE38."

El documento WO 2008/052322 describe una forma truncada de exotoxina A de Pseudomonas que consiste en los aminoácidos 252 a 608 o una variante de estos.

A pesar de estas décadas de esfuerzos, las actuales inmunotoxinas basadas en PE todavía no son plenamente satisfactorias. Aunque las inmunotoxinas PE38 que han llegado a ensayos clínicos son relativamente bien toleradas a dosis bajas, las toxicidades limitantes de la dosis han restringido su efecto terapéutico. En un ensayo clínico de fase t de una inmunotoxina basada en PE conocida como LMB-2, las toxicidades limitantes de la dosis por encima de 40 I-lg/kg administrada en días alternos (QOD) X 3 consistió en elevación de las transaminasas, diarrea, miocardiopatía y una reacción alérgica (Kreitman, R.J. y otros, J Clin Oncol, 18:1622-1636 (2000) ) . En un ensayo clinico de fase I de una inmunotoxina anti-mesotelina, denominada como SS1P, se encontró que los efectos adversos de pleuritis, urticaria, y el síndrome de fuga vascular eran limitantes de la dosis (Hassan, R. y otros, Clin Cancel Res, 13:144-5149 (2007". En un ensayo de fase I de una tercera inmunotoxina basada en PE, BL22, las toxicidades limitan tes de la dosis incluyeron varios casos de síndrome urémico hemolílico y un síndrome de liberación de citocinas con sindrome de fuga vascular sistémica (Kreitman, R.J. y otros, J Clin Oncol, 23:6719-6729 (2005) ) .

Adicionalmente, las inmunotoxinas basadas en PE actualmente en ensayos clinicos son altamente inmunogénicas Se ha demostrado que esto no es un problema en el tratamiento de neoplasias malignas hematológicas, donde frecuentemente está comprometida la capacidad del sistema inmune para armar una respuesta. Las inmunotoxinas típicamente pueden administrarse varias veces a pacientes con neoplasias malignas hematológicas. Los pacientes con tumores sólidos, sin embargo, usualmente desarrollan anticuerpos neutralizantes a las inmunotoxinas basadas en PE en cuestión de semanas después de la primera administración. Dado que muchos protocolos requieren un período de tres semanas entre las administraciones de inmunotoxinas, el desarrollo de anticuerpos durante este período significa efectivamente que, para tumores sólidos, usualmente sólo puede realizarse una administración de una inmunotoxina basada en PE antes que los anticuerpos del paciente la vuelvan ineficaz. Incluso una sola administración de una inmunotoxina basada en PE puede ser muy útil en reducir la carga tumoral del paciente, en eliminar metástasis más pequeñas, yen aliviar los sintomas, pero la capacidad de administrar múltiples dosis evidentemente sería muy útil

Un número limitado de enfoques se han desarrollado como un intento de abordar estos problemas. Un enfoque para reducir la toxicidad inespecífica, al reducir el punto isoeléctrico de las regiones marco de los Fv usados como la porción de direccionamiento de las inmunotoxinas, se informó en la Solicitud del PCT conjunta núm. PCT/US01/43602, publicada como Publicación Internacional núm. WO 02/40545. Un enfoque para reducir la inmunogenicidad se describe en la Solicitud del PCT conjunta núm. PCT/US061028986, publicada como documento WO 20071016150 , que informa el mapeo de los diferentes epítopos de PE y mutaciones de residuos de aminoácidos individuales que pueden combinarse para reducir la inmunogenicidad global de la molécula de PE resultante en comparación con la de PE38. Sin embargo, seria deseable tener enfoques adícíonales para reducir la toxícidad límitante de la dosis de la ínmunotoxina Adicionalmente, seria deseable tener enfoques adicionales para reducir la inmunogenicidad de PE y de inmunotoxinas en las que PE actúa como la porción tóxica. La presente invención satisface esta y otras necesidades.

6S

Breve resumen de la invención En un primer aspeclo, la invención proporciona una exoloxina A de Pseudomonas (PE) mulada, aislada que comprende una secuencia de la fórmula: R'n_FCS_R2n_R3n_PE dominio 111 funcional, en donde: n "" O o 1 independientemente para cada uno de R1, R2 Y R3;

R1

"" 1 a 10 residuos de aminoácidos; FCS: una secuencia de escisión de furina de los residuos de aminoácidos, cuya secuencia es escindible por furina y tiene un exlremo de aminoácido y un extremo carboxilo, en donde la FeS

a) se representa por la fónnula P4-P3-P2-P1 , en donde P4 es un residuo de aminoácido en el extremo amino, P1 es un residuo de aminoacido en el extremo carboxilo, P1 es una arginina o un residuo de lisina, y dicha secuencia es escindible en el exlremo carboxilo de P1 por la furina; b) (i) adicionalmente comprende residuos de aminoácidos representados por P6-P5 en dicho extremo amino,

(ii) adicionalmente comprende residuos de aminoácidos representados por P1'-P2' en dicho extremo carboxilo,

(iii) en donde además P1 es una arginina o un residuo de lisina, P2' es Iriplófano, y P4 puede ser arginina, valina o lisina, siempre y cuando si P4 no es arginina, entonces P6 y P2 son residuos básicos, y (iv) dicha secuencia es escindible en el exlremo carboxilo de P1 por furina; c) se selecciona de las seco con núms. de ident:12-20; d) es la seco con núm. de iden\.:10, o una versión truncada de esta que comprende RQPR (sec. con núm. de ident:21 ) ; o e) es la sec con núm de ident ·11, o una versión truncada de esta que comprende RSKR (sec con núm de ident. :26) ;

R2= 1 a 10 aminoacidos; y R3

= 1 o más residuos contiguos de los residuos 365-394 de la sec con núm. de idenL:1 ; el dominio 111 funcional de PE son los residuos 395-613 de la seco con núm. de idenL:1, opcionalmente que comprende (i) sustituciones en uno o más residuos que corresponden a 609-613 de la seco con núm. de iden\.:1 , (ii) una sustitución de glicina, alanina, valina, leucina, o isoleucina por arginina en una posición que corresponde a la posición 490 de la seco con núm. de iden\.:1, (iii) una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina por uno o más residuos que corresponden a los residuos seleccionados de 0403, R412, R427, E431, R432, R458, 0461, R467, R505, R513, E522, R538, E548, R551, R576, K590, Y L597 de la seco con núm. de iden!.:1, cuyos residuos de la seco con núm. de ident.:l mantienen inmunogenicidad de un epítopo o subepítopo del dominio 111 de PE, o (iv) una combinación de cualquiera de (i) - (iii) , en donde la PE mutada no incluye los residuos 1 a 273 y 285 a 364 de la seco con núm. de iden!.:1.

En un segundo aspecto la invención proporciona una molécula quimérica que comprende

(a) una citocina, anticuerpo o fragmento de anticuerpo, dicha citocina, anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une específicamente a un antigeno o receptor sobre una superficie celular, conjugado o fusionado a

(b) una PE mutada de acuerdo con cualquier modalidad del primer aspecto de la invención 5

En algunas modalidades, la FeS puede representarse mediante la fórmula P4-P3-P2-P1 (sec. con... [Seguir leyendo]

1. Una exotoxinaa A de Pseudomonas (PE) aislada, mutada que comprende una secuencia de la fórmula: R\ . FCS_R2n_R3n_PE dominio 111 funcional, en donde:

n := Oo 1 independientemente para cada uno de R1, R2 Y R3;

R1

= 1 a 10 residuos de aminoácidos; FeS = una secuencia de escisión de furina de residuos de aminoácidos, la secuencia es escindible por furina y tiene un extremo aminoácido y un extremo carboxilo, en donde la FeS·

al es representada por la fórmula P4-P3-P2-P1, en donde P4 es un residuo de aminoácido en el extremo amino, P1 es un residuo de aminoácido en el extremo carboxilo, P1 es una arginina o un residuo de lisina, y dicha secuencia es escindible en el extremo carboxilo de P1 por furina; b) (i) adicionalmente comprende residuos de aminoácidos representados por P6-P5 en dicho extremo

amino, (ii) adicionalmente comprende residuos de aminoácidos representados por P1'-P2' en dicho extremo carboxilo, (iii) en donde además P1 es una arginina o un residuo de lisina, P2' es !riptótano, y P4 puede ser arginina, valina o lisina, siempre y cuando si P4 no es arginina, entonces P6 y P2 son residuos básicos, y (iv) dicha secuencia es escindible en el extremo carboxilo de P1por furina; c) se selecciona de las seco con núms. de iden!.: 12-20; d) es la seco con núm. de iden!.. 10, o una versión truncada de esta que comprende RQPR (sec. con núm. de iden!.. 21 ) ; or e) es la seco con núm de iden! . 11 , o una versión truncada de esta que comprende RSKR (sec con núm de iden!.: 26) ;

R2

= 1 a 10 aminoácidos; y R:$ = 1 o más residuos contiguos de los residuo.

36. 394 de seco con núm. de iden!.: 1; el dominio 111 de PE funcional son los residuo.

39. 613 de la seco con núm. de iden! · 1, que comprende opcionalmente (i) sustituciones en uno o más residuos que corresponden .

60. 613 de la seco con núm. de iden!.. 1, (ii) una sustitución de glicina, alanina, valina, leucina, o isoleucina por arginina en una posición que corresponde a la posición 490 de la seco con núm. de iden!.: 1, (iii) una sustitución de alanina. glicina, serina o glutamina por uno o más residuos que corresponden a los residuos seleccionados de 0403, R412, R427, E431, R432, R45B, 0461, R467, R505, R513, E522, R538, E548, R551, R576, K590, y L597 de la seco con núm. de iden!.: 1, donde los residuos de la seco con núm. de iden!.: 1 mantienen inmunogenicidad de un epitopo o subepitopo del dominio 111 de PE, o (iv) una combinación de cualquiera de (i) - (iii) , en donde el PE

mulada no incluye los residuos 1 a 273 y 285 a 364 de la seco con núm. de iden!.: 1.

2. El PE mutado de la reivindicación 1, en donde n=O para R3

3. El PE mutado de la reivindicación 1, en donde FeS se conjuga o fusiona directamente al dominio 11 1funcional de PE

4. El PE mutado de la reivindicación 1, en donde el dominio 111 funcional de PE consiste en la secuencia de residuo.

39. 613 de la seco con núm. de iden!.: 1

5. El PE mutado de la reivindicación 1, en donde el dominio 111 funcional de PE comprende (i) sustituciones sustituciones en uno o más residuos que corresponden .

60. 613 de la seco con núm. de iden!.: 1, (ii) una sustitución de glicina, alanina, valina, leucina, o isoleucina por arginina en una posición que corresponde a la posición 490 de la seco con núm. de iden!.. 1, (iii) una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina por uno o más residuos que corresponden a los residuos seleccionados de 0403, R412, R427, E431 , R432, R458, 0461, R467, R505, R513, E522, R538, E548, R551, R576, K590, y L597 de la seco con núm. de iden!.. 1, donde los residuos de la seco con núm. de iden!.. 1 mantienen inmunogenicidad de un epítopo o subepitopo del dominio 111 de PE, o (iv) una combinación de cualquiera de (i) - (iii) .

6. Una molécula quimérica que comprende

(a) una citocina, anticuerpo o fragmento de anticuerpo, cuya citocina, anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une específicamente a un antígeno o receptor sobre una superficie celular, conjugado o fusionado a

(b) una PE mutada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 5, en donde la molécula quimérica no incluye los residuos 1 a 273 y 285 a 364 de la seco con núm. de iden!.. 1.

7. La molécula quimérica de la reivindicación 6, en donde además (a) es un anticuerpo o fragmento de este que conserva la capacidad de reconocimiento del antígeno

8. La molécula quimérica de la reivindicación 7, en donde dicho anticuerpo o fragmento de este se une a un antígeno objetivo seleccionado de mesotelina o CD22

9. Una molécula quimérica para su uso en la inhibición del crecimiento de una célula objetivo que tiene un 5 exterior, dicha molécula quimérica comprende:

(a) una citocina, anticuerpo o fragmento de anticuerpo, cuya citocina, anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une específicamente a un antígeno o receptor en el exterior de dicha célula, conjugado o fusionado a (b) una PE mulada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 5, en donde la molécula quimérica no incluye 10 los residuos 1 a 273 y 285 a 364 de la secocon núm. de iden!.: 1_

10. La molécula quimérica de la reivindicación 9, en donde ademas (a) es un anticuerpo o fragmento de este que conserva la capacidad de reconocimiento del antigeno.

11. La molécula quimérica de la reivindicación 10, en donde dicho anticuerpo o fragmento de este se une a un antigeno objetivo seleccionado de mesotelina o CD22

12. Un ácido nudeico aislado, dicho ácido nudeico que codifica la PE mutada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 5. 20

13. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 12, en donde además dicho ácido nucleico codifica una citocina, anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un antígeno o receptor sobre una superficie celular, cuya citocina, anticuerpo o fragmento de anticuerpo está fusionado directamente o a través de un enlazador peptídico a dicha PE mutada.

14. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 13, en donde dicho ácido nudeico codifica un anticuerpo o fragmento de este que conserva la capacidad de unión al antígeno.

15. El ácido nudeico aislado de la reivindicación 14, en donde dicho anticuerpo o fragmento de este se une a un 30 antígeno objetivo seleccionado de mesotelina o CD22.