Anticuerpos monoclonales humanos contra los virus Hendra y Nipah.

Un anticuerpo humano que se une selectivamente al epítopo de la glucoproteína G de Hendra y Nipah,

en el que dicho anticuerpo incluye una cadena pesada variable y una cadena ligera variable, en el que la cadena ligera variable tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 313 y en el que el anticuerpo se puede obtener mediante maduración por afinidad con respecto a un anticuerpo m102 que comprende una cadena pesada variable que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 17 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 25.

Anticuerpos monoclonales humanos contra los virus Hendra y Nipah

Campo de la invención La presente invención se refiere en general al campo de la inmunología y, específicamente, a los anticuerpos monoclonales que se unen o neutralizan los virus Hendra y Nipah.

Antecedentes de la invención El virus Nipah (NiV) y el virus Hendra (HeV) son paramixovirus emergentes estrechamente relacionados, que comprenden el género Henipavirus (Anónimo 1999 MMWR Morb Mortal Wkly Rep Ward, J. W. ed. 48:335-337; Chew, M. H. et al. 2000 J Infect Dis 181:1760-1763; Chua, K. B. et al, 2000 Ann Neurol 48:802-805; Eaton, B. T. 15 2001 Microbes Infect 3:277-278; Goh, K. J. et al. 2000 N Engl J Med 342:1229-1235; Lee, K. E. et al 1999 Ann Neurol 46:428-432; Lim, C. C. et al. 2000 Am J Neuroradiol 21:455-461; Murray, K. et al. 1995 Science 268:94-97) . Los paramixovirus son virus con cubierta que contienen ARN de sentido negativo y contienen dos glucoproteínas principales de la cubierta ancladas a la membrana que son necesarias para la infección de una célula huésped receptora. Todos los miembros contienen una glucoproteína F que participa en la fusión de membranas independiente del pH entre el virus y su célula huésped, mientras que la segunda glucoproteína de unión puede ser una proteína hemaglutinina-neuraminidasa (HN) , una proteína hemaglutinina (H) o una proteína G, dependiendo del virus particular (revisado en Lamb, R. A. y Kolakofsky, D. 2001 in Fields Virology, eds. Knippe, D. M. & Howley, P. M., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, págs. 1305-1340) . Al igual que con todos los paramixovirus, estas glucoproteínas son también los antígenos principales a los que se dirigen prácticamente todos los anticuerpos neutralizantes.

Los amplios tropismos de la especie y la capacidad para provocar una enfermedad mortal tanto en animales como en seres humanos distinguen a HeV y NiV de todos los otros paramixovirus conocidos (revisado en Eaton, B. T. 2001 Microbes Infect 3:277-278) . Son patógenos de Nivel 4 de Seguridad Biológica (BSL-4) y están en la agenda de investigación para la biodefensa del NIAID como patógenos prioritarios de categoría C emergentes zoonóticos que se podrían usar como agentes de bioterrorismo. Los henipavirus se pueden amplificar y provocar enfermedad en animales grandes, y se pueden transmitir mediante aerosoles a seres humanos, en los que la enfermedad puede ser una enfermedad respiratoria grave y encefalitis febril. Pueden crecer fácilmente en cultivo celular o en huevos de pollo embrionario, producen títulos no concentrados elevados (DICT50/ml ~108; Crameri, G. et al. 2002 J Virol

Methods 99:41-51) y son muy infecciosos (Field, H. et al. 2001 Microbes Infect 3:307-314; Hooper, P. et al. 2001 Microbes Infect 3:315-322) .

NiV ha reaparecido recientemente en Bangladesh. Se han confirmado dos brotes de NiV en 2004 e incluso se ha producido otro en enero de 2005 (Anónimo 2005 Communicable Disease Report Weekly (CDR Weeldy) Vol. 15 No. 16) . En estos brotes más recientes se han realizado varias observaciones importantes, incluyendo una mayor incidencia de síndrome de dificultad respiratoria aguda, transmisión de persona a persona y tasas de mortalidad de casos significativamente mayores (60-75 %) que en Malasia (aproximadamente del 40 %) , donde se descubrió o se sospechó que se había originado el virus (Anónimo 2004 Wkldy Epidemiol Rec 79:168-171; Anonymous 2004 Health and Science Bulletin (ICDDRB) 2:5-9; Butler, D. 2004 Nature 429:7; Enserink, M. 2004 Science 303:1121; Hsu, V. P. 45 et al. 2004 Emerg Infect Dis 10:2082-2087) . Actualmente, no hay ningún tratamiento para individuos infectados por NiV o HeV y no existe ninguna vacuna para la prevención de la enfermedad en poblaciones humanas o de ganado. Aunque se detectaron respuestas de anticuerpos en infecciones provocadas por estos virus, no se han identificado anticuerpos monoclonales humanos (hmAb) frente a ninguno de los virus. Un número de estudios ha demostrado la importancia de los anticuerpos neutralizantes en la recuperación y protección frente a infecciones víricas (Dimitrov,

D. S. 2004 Nat Rev Microbiol 2:109-122) . Por lo tanto, el desarrollo de hmAb neutralizantes frente a NiV y HeV podría tener implicaciones importantes para la profilaxis e inmunoterapia pasiva. Además, la caracterización de los epítopos de los anticuerpos neutralizantes podría proporcionar información útil para el desarrollo de vacunas y fármacos candidatos. Finalmente, tales anticuerpos se podrían usar para el diagnóstico y como agentes de investigación.

J. Virol. 78 (2) :834-840 (2004) divulga el uso de glucoproteínas G y F del virus Nipah para vacunar hámsteres. Virology 296:190-200 (2002) divulga que las glucoproteínas G y F del virus Nipah inducen una respuesta de anticuerpos neutralizantes en ratones. Virology 271:334-349 (2000) divulga que las proteínas de los virus Nipah y Hendra comparten grados variables de homología de aminoácidos.

Transición a la invención En el presente documento, los inventores notifican la identificación de hmAb neutralizantes potentes dirigidos a la glucoproteína G de cubierta vírica, usando como antígeno una glucoproteína G de HeV soluble (sG) oligomérica, 65 muy purificada, para la detección selectiva en una gran biblioteca de presentación en fagos humana sin exposición previa. Uno de estos anticuerpos mostró una potencia excepcional frente a HeV infeccioso y otro neutralizó tanto a

HeV como a NiV. Debido a que estos anticuerpos son anticuerpos completamente humanos, sirven como base para la profilaxis y tratamiento de seres humanos infectados con HeV o NiV.

Sumario de la invención La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales que se unen a o neutralizan los virus Hendra o Nipah. La invención proporciona anticuerpos humanos que retienen la capacidad para unirse a los virus Hendra o Nipah y composiciones farmacéuticas que incluyen tales anticuerpos. La invención proporciona además ácidos nucleicos aislados que codifican los anticuerpos de la invención y células huéspedes transformadas con ellos. Adicionalmente, la invención proporciona métodos profilácticos, terapéuticos y de diagnóstico que emplean los anticuerpos de la invención.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Actividad inhibidora significativamente mayor de IgG1 m101 que Fab m101 en la fusión celular mediada por Env de HeV. Células HeLa-USU se infectaron con recombinantes del virus vacunal que codifican las glucoproteínas F y G de HeV y con un recombinante del virus vacunal que codifica la ARN polimerasa de T7 (células efectoras) . Cada tipo de célula diana designado se infectó con el virus vacunal indicador vCB21R, que codifica lacZ de E. coli. IgG1 m101 y Fab m101 se preincubaron con células efectoras y después se mezclaron con células diana. El ensayo de fusión celular se llevó a cabo durante 2, 5 horas a 37 ºC. La fusión se midió como se describe en el Ejemplo 1. En A se muestra la inhibición de la fusión mediada por Env de HeV por IgG1 m101 y Fab m101 en las células HeLa-ATCC y en B se muestra la de las células PCI-13. El porcentaje de fusión se muestra como función de la concentración de anticuerpos. Las curvas representan el mejor ajuste de los datos experimentales a partir del cual se calcularon las CI50 usando el software Prism GraphPad.

Figura 2: Inhibición mediante m101 de la formación de sincitios mediada por Env de HeV. Las células efectoras, preparadas como se describe en la leyenda de la Figura 1, se preincubaron con IgG1 m101, Fab m101 o el anticuerpo control irrelevante (X5 específico del VIH (Moulard, M. et al. 2002 Proc Natl Acad Sci USA 99:69136918) ) durante 20 minutos a temperatura ambiente; después, 2 x 105 células en 200 µl se superpusieron sobre monocapas de células PCI-13 confluentes al 80 % colocadas en una placa de 48 pocillos y se incubaron durante 3 horas a 37 ºC en una atmósfera de CO2 al 5 % humidificada. Se tomaron fotografías usando microscopio de contraste de fases, con un objetivo de 10 aumentos. Se muestran porciones ilustrativas de las fotografías originales que, por claridad, se amplifican electrónicamente. Las fotos superior e inferior del panel izquierdo muestran la formación de sincitios en ausencia de anticuerpo o en presencia de un anticuerpo control; se contaron 17 o 20 células fusionadas gigantes (sincitios) por vista fotográfica completa, respectivamente. Las fotos superior e inferior del panel derecho muestran la inhibición completa de la formación de sincitios mediante IgG1 m101 o la reducción a 10 µg/ml mediante Fab m101 en el número de sincitios; había 0 o 9 sincitios por vista completa, respectivamente. Figura 3. Inmunoprecipitación de glucoproteínas G de HeV y NiV... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo humano que se une selectivamente al epítopo de la glucoproteína G de Hendra y Nipah, en el que dicho anticuerpo incluye una cadena pesada variable y una cadena ligera variable, en el que la cadena ligera variable tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 313 y en el que el anticuerpo se puede obtener mediante maduración por afinidad con respecto a un anticuerpo m102 que comprende una cadena pesada variable que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 17 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 25.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo comprende un fragmento Fd.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo comprende un fragmento Fab.

4. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la cadena variable comprende una región CD3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 311.

5. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la cadena variable comprende una región CD2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 309.

6. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

7. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 6, en el que el ácido nucleico comprende un vector que incluye una secuencia reguladora unida operablemente a dicho ácido nucleico.

8. Una célula huésped aislada que produce el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

9. Una preparación farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

10. Una preparación diagnóstica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

11. Una preparación farmacéutica de la reivindicación 9 para su uso en el tratamiento de la enfermedad por el virus Hendra o la enfermedad por el virus Nipah.

12. Una preparación farmacéutica de la reivindicación 9 para su uso en la profilaxis de la enfermedad por el virus Hendra o la enfermedad por el virus Nipah.

13. Una preparación diagnóstica de la reivindicación 10 para su uso en el diagnóstico de la enfermedad por el virus Hendra o la enfermedad por el virus Nipah mediante la detección de la unión del anticuerpo como una determinación de la presencia de enfermedad por el virus Hendra o la enfermedad por el virus Nipah.

14. Un método de detección de la presencia de virus Hendra o Nipah en una muestra biológica, que comprende poner en contacto dicha muestra con la preparación diagnóstica de acuerdo con la reivindicación 10 y analizar la unión del anticuerpo como una determinación de la presencia de dicho virus Hendra o Nipah.