Procedimiento para el aislamiento de un ARN a partir de muestras de sangre entera.

Procedimiento para el aislamiento del ARN a partir de una muestra de sangre entera,

que comprende las etapas de:

a) poner en contacto la muestra con una solución acuosa de lisis, que contiene por lo menos una sustancia para lisis en una concentración de 1,5 mol/l a 7 mol/l, por lo menos un detergente y unos iones de magnesio,

b) añadir simultánea o subsiguientemente una proteinasa, en particular la proteinasa K,

c) después de esto, incubar la solución, que se había obtenido de acuerdo con la etapa b), para realizar una digestión enzimática y una lisis por lo menos parciales de la muestra, obteniéndose un material lisado, y

d) aislar el ARN a partir del material lisado,

poniéndose en contacto la muestra en la etapa a) directamente con la solución de lisis y no siendo diluida ésta hasta la finalización de la etapa c) mediante la adición de más cantidad de disolvente, no añadiéndose ningún agente estabilizador y/o no centrifugándose, realizándose que el volumen total, que está constituido por la muestra, la solución acuosa de lisis y la proteinasa, sobrepasa al volumen de partida de la muestra hasta la finalización de la etapa c) en no más que el factor de 2,5, de manera preferida en no más que el factor de 1,5.

Procedimiento para el aislamiento de un ARN a partir de muestras de sangre entera

El presente invento se refiere a un procedimiento para el aislamiento de un ARN a partir de una muestra de sangre entera.

La sangre constituye una fuente accesible para un ARN de procedencia animal o humana. La sangre se compone de unos componentes celulares y del plasma, fluctuando la proporción de células según sea el sexo y la edad, pero usualmente ella está situada en promedio en un 44 %. Condicionado por esta alta proporción celular, la sangre es designada frecuentemente también como un "tejido líquido".

A pesar de esta alta proporción celular en la sangre, el número de células metabólicamente activas es extremadamente pequeño. Así, los leucocitos que son portadores de los ADN y ARN constituyen de manera aproximada sólo de un 0,1 a 0,2 % de la fracción celular, estando constituida la población de células, que es con mucho la más grande, por unos eritrocitos maduros. Sin embargo, éstos están exentos de núcleos, es decir que por regla general no llevan ningún ARN, pero a cambio mucha más cantidad de hemoglobina para el transporte del oxígeno en la sangre.

Debido al ADN que, en comparación con el ARN, está más fuertemente representado en la sangre, el aislamiento de un ADN genómico a partir de la sangre es relativamente sencillo de realizar. La alta estabilidad del ADN es, en el presente caso, asimismo ventajosa. En comparación con esto, el aislamiento de un ARN intacto es extremadamente complicado, en particular cuando el ARN debe de ser aislado del modo más completo que sea posible a partir de la muestra de sangre. Tal como ya se ha indicado precedentemente, esto está condicionado, por una parte, por la pequeña proporción de células, que son portadoras de ARN.

Otro factor de dificultad lo constituye la alta concentración de ARNasas en la sangre, que se presentan tanto intracelular como también extracelularmente. Si las ARNasas no son desactivadas del modo más rápido y completo que sea posible, ellas conducen a una degradación del ARN y por lo tanto a otra reducción más amplia de la concentración de ARN.

Otro problema lo constituye la separación, que se hace necesaria, de la hemoglobina, puesto que el hemo, que es portador de hierro, constituye un agente inhibidor extremadamente potente de la reacción en cadena de la polimerasa (en inglés "polymerase chaln reactlon", PCR).

Dejando a un lado las dificultades bioquímicas precedentemente mencionadas, que se establecen en el caso de la extracción de un ARN a partir de unas muestras de sangre, la viscosidad de la sangre, que ocasionalmente es muy alta, resulta problemática. Sobre todo en el caso de una alta proporción celular (un hematocrito), que se puede presentar por ejemplo debido a una enfermedad, la sangre entera es especialmente viscosa y por lo tanto difícil de procesar.

La mayoría de los procedimientos, que se están empleando hoy en día para el aislamiento de un ARN a partir de una sangre entera, se basan en la separación de los leucocitos que contienen el ARN con respecto del resto de la sangre con sus componentes celulares y exentos de células.

El método más original de obtener una fracción pura de leucocitos es la centrifugación con un gradiente de densidades (Bóyum, 1968; Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood [Aislamiento de células mononucleares y granulocitos a partir de una sangre humana]. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 (Suplemento 97):77-89). Constituyen una alternativa los denominados tubos CPT (de Becton, Dlcklnson and Company, BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube = "Tubo para la preparación de sangre"), los cuales contienen un gel polimérlco y, después de haber añadido sangre y de haber centrifugado, permiten la retirada de la fracción de leucocitos. No obstante, estos costosos métodos no son apropiados, o lo son solamente de modo muy restringido, para el aislamiento y el análisis de un ARN, puesto que el perfil celular de un ARN no queda estabilizado ni "congelado". En el transcurso del procesamiento se llega Inevitablemente a unas modificaciones en la expresión génica, de tal manera que se dificulta o se hace Imposible la realización de un análisis de unos patrones de expresión. Con el fin de analizar el ARN de las muestras, es necesario, por lo tanto, controlar muy estrictamente a aquellos factores que influyen sobre la expresión génica. SI se crean - aunque sea solo por poco tiempo - unas condiciones no fisiológicas (p.ej. por una centrifugación, una recogida de células, una dilución, etc.), entonces no se puede excluir un perjuicio para la expresión génica.

Un método habitual para enriquecer a los leucocitos es la lisis selectiva de los eritrocitos (Karavltakl y colaboradores, 2005, Molecular staging using qualitative RT-PCR analysls detectlng thyreoglubulln mRNA ¡n the perlphereal Blood of patients wlth dlfferentiated thyroid cáncer aftertherapy [Puesta en escena molecular usando un análisis cualitativo de RT-PCR detectando el ARNm de la tireoglobulina en la sangre periférica de unos pacientes que padecen de un cáncer de tiroides diferenciado después de la terapia], Anticancer Research 25: 3135-3142). Este método se ha descrito además en el documento de patente europea EP 0 875 271 y en el documento de patente de los EE.UU.

US 5.702.884. Expresado de un modo sencillo, los eritrocitos son Usados mediante la adición de algunos volúmenes de una solución de cloruro de amonio o de otras formulaciones que actúan selectivamente, mientras que los leucocitos permanecen intactos en las condiciones escogidas. Después de haber efectuado una centrifugación, el sedimento de leucocitos se lava, se vuelve a suspender y el ARN se aísla a partir de las células. Una gran desventaja es el aumento inmanejable del volumen de la muestra, que va acompañado por una dilución adicional de la muestra, puesto que, por regla general, se tienen que ajustar unas condiciones hipotónicas mediante la adición de varios volúmenes de la solución de lisis. También las repetidas etapas de centrifugación requieren mucho tiempo y no pueden ser automáticas, lo que constituye una grave desventaja. Mediante las condiciones no fisiológicas que se presentan durante la dilución se puede llegar además a una modificación de los perfiles de expresión génica, que hace difícil realizar un análisis posterior. La alta necesidad de tiempo de este método favorece todavía más este efecto. Puesto que las ARNasas tampoco son reprimidas durante la lisis selectiva, y además la calidad y la cantidad de los ARN aislados son generalmente bajas.

Otra posibilidad, de separar a los leucocitos con respecto de los demás componentes restantes de la sangre, es el aislamiento de un denominado "buffy-coat" (un revestimiento leucocitario anteado). En el presente caso, una sangre anticoagulada se centrifuga con una baja aceleración (de aproximadamente 2.000 x g). El revestimiento leucocitario anteado, que contiene predominantemente las células sanguíneas blancas (los leucocitos), se puede retiraren forma de una capa entre el plasma y los eritrocitos empaquetados. En este caso resulta ventajoso el hecho de que los leucocitos son recolectados en unas condiciones casi fisiológicas, y en este caso faltan completamente unas diluciones. No obstante, el procesamiento requiere mucho tiempo y trabajo, necesita mucha experiencia práctica y habilidad, y no se pueden excluir unas modificaciones de los modelos de expresión génica causadas por la centrifugación y el procesamiento. A esto se agrega también el riesgo de un material de muestra infeccioso en el caso de la manipulación, al igual que la ausencia de una posibilidad de automatizar este proceso.

Otra posibilidad, de enriquecer leucocitos, se ha descrito en el documento de solicitud de patente de los EE.UU. US 2005/0208501 A1. En el presente caso, se emplea una membrana, que fija selectivamente a los leucocitos a partir de una sangre entera. Originalmente, tales membranas se emplearon en el caso de transfusiones de sangre, con el fin de excluir unas enfermedades del tipo de "injerto frente al anfitrión" (en Inglés "graft vs. host", en el caso de los Individuos receptores de sangre. Para la extracción de un ARN a partir de una sangre entera, ésta es conducida a través de la membrana (y centrifugada). Los leucocitos se fijan y pueden ser Usados seguidamente. En comparación con la centrifugación en un gradiente de densidades o con la obtención de un revestimiento leucocitario anteado, este método es desigualmente más sencillo pero, a pesar de todo, en este caso tampoco se puede excluir una modificación de los perfiles de expresión génica, puesto que las muestras son centrifugadas de un modo "no fisiológico" y las células son fijadas... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para el aislamiento del ARN a partir de una muestra de sangre entera, que comprende las etapas

de:

a) poner en contacto la muestra con una solución acuosa de lisis, que contiene por lo menos una sustancia para lisis en una concentración de 1,5 mol/l a 7 mol/l, por lo menos un detergente y unos iones de magnesio,

b) añadir simultánea o subsiguientemente una proteinasa, en particular la proteinasa K,

c) después de esto, incubar la solución, que se había obtenido de acuerdo con la etapa b), para realizar una digestión enzimática y una lisis por lo menos parciales de la muestra, obteniéndose un material lisado, y

d) aislar el ARN a partir del material lisado,

poniéndose en contacto la muestra en la etapa a) directamente con la solución de lisis y no siendo diluida ésta hasta la finalización de la etapa c) mediante la adición de más cantidad de disolvente, no añadiéndose ningún agente estabilizador y/o no centrifugándose, realizándose que el volumen total, que está constituido por la muestra, la solución acuosa de lisis y la proteinasa, sobrepasa al volumen de partida de la muestra hasta la finalización de la etapa c) en no más que el factor de 2,5, de manera preferida en no más que el factor de 1,5.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa c) las ARNasas, que están contenidas en la solución, son desactivadas de una manera amplísimamente completa.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que la solución acuosa de lisis contiene la sustancia para lisis en una concentración de 2 mol/l a 6 mol/l, en particular de 2,5 mol/l a 5 mol/l, de manera preferida de 3 mol/l a 4 mol/l.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la solución acuosa de lisis se mezcla con la muestra en una relación volumétrica de 1,8 : 1 a 1 : 1,8, en particular de 1,5 : 1 a 1 : 1,5, de manera preferida de 1,2 : 1 a 1 : 1,2.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que en la etapa b) la proteinasa se añade como un material sólido en común con un disolvente o como una solución de una proteinasa, ajustándose la respectiva cantidad de líquido de tal manera que la cantidad de líquido sea a lo sumo de 20 % del volumen de la muestra y de la solución acuosa de lisis, en particular a lo sumo de 10 %.

6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la sustancia para lisis comprende una o varias sales caotrópicas, y en particular se escoge entre unos tiocianatos, tales como el tiocianato de sodio, el tiocianato de potasio y el tiocianato de guanidinio, la urea, y unas sales percloratos tales como el perclorato de sodio y/o el yoduro de potasio.

7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la solución de lisis contiene unos iones de magnesio en una concentración de 10 a 1.000 mMol/l, de manera preferida de 100 a 600 mMol/l, de manera más preferida de 150 a 400 mMol/l.

8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la sustancia para lisis comprende los tiocianatos de potasio y/o de sodio, y la solución de lisis contiene unos iones de calcio, siendo la concentración de iones de calcio en particular de 10 a 150 mMol/l, de manera preferida de 50 a 100 mMol/l.

9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la solución de lisis está exenta de iones de metales di- o plurivalentes con la excepción de magnesio y calcio.

10. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que el detergente se escoge entre unos detergentes no iónicos, unos detergentes aniónicos o unas mezclas de éstos, en particular un poli(oxietilen)-20-cetil-éter (Brij 58®) o la N-lauroíl-sarcosina.

11. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la solución de lisis contiene otras sustancias constituyentes, que se escogen en particular entre unas sustancias tamponadoras, unas enzimas, unos agentes de reducción y/o unos alcoholes.

12. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que para el aislamiento del ARN a partir del material lisado, el ARN reacciona por adición con una fase sólida, en caso deseado seguido por una o varias etapas de lavado.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque para la reacción por adición del ARN a la fase sólida, al material lisado se le añade un agente de fijación, en particular un alcohol, de manera preferida el etanol y/o el isopropanol, así como una mezcla de un alcohol y agua.

14. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que el ADN se elimina por lo menos parcialmente, de manera preferida casi completamente, en particular mediante una digestión con una ADNasa.

15. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el ARN aislado se obtiene, en particular, mediante una desorción.

16. Utilización de un estuche para el aislamiento del ARN a partir de una muestra de sangre entera de acuerdo con 10 una de las reivindicaciones 1 hasta 15, que contiene por lo menos los siguientes componentes:

a) una solución acuosa de lisis, que contiene por lo menos una sustancia para lisis en una concentración de 1 mol/l a 5 mol/l

b) por lo menos un detergente,

c) unos iones de magnesio,

d) una proteinasa, en particular la proteinasa K.