Procedimiento para la desparafinación de muestras biológicas.

Procedimiento para el aislamiento de biomoléculas a partir de una muestra biológica fijada,

embebida en parafina, que comprende las etapas de:

poner en contacto la muestra

a) con un disolvente no miscible con agua y disolver la parafina en este disolvente mediando formación de una fase orgánica líquida, y

b) con una solución acuosa de por lo menos una sustancia para lisis y/o con agua y por lo menos una sustancia para lisis mediando formación de una fase acuosa,

formándose por medio de las etapas a) y b) una mezcla de dos fases; y seguidamente

aislar las biomoléculas a partir de la fase acuosa.

Procedimiento para la desparafinación de muestras biológicas.

Memoria descriptiva

El presente invento se refiere a un procedimiento para el aislamiento de biomoléculas a partir de una muestra biológica fijada, embebida en parafina, a un estuche, que incluye las sustancias necesarias para la realización del procedimiento conforme al invento, así como a la utilización del estuche conforme al invento para la realización del procedimiento de aislamiento.

A partir del estado de la técnica se conocen unos procedimientos para el aislamiento de biomoléculas a partir de muestras biológicas fijadas, embebidas en parafina. Por el concepto de una muestra fijada, se entiende en el presente caso una muestra biológica, que se hace estable de una manera conocida mediante un tratamiento, por ejemplo, con una solución de formaldehído, con etanol anhidro o con soluciones alcohólicas de carácter ácido. Para el mejoramiento adicional de la estabilidad en almacenamiento, estas muestras son transferidas a continuación a una parafina. Las muestras tratadas con formalina y embebidas en parafina son designadas también como un material FFPE (acrónimo de Formalin Fixierte, Paraffin Eingebettetes, embebido en parafina, fijado con formalina) . Las muestras fijadas y embebidas con ayuda de estos métodos se pueden emplear, por ejemplo, para investigaciones histopatológicas y/o a continuación se pueden conservar durante un período de tiempo muy largo, sin que se llegue a una modificación digna de mención de las biomoléculas contenidas en estas muestras. En particular, incluso después de unos prolongados períodos de tiempo, a partir de estas muestras se pueden extraer todavía los ácidos nucleicos, es decir los ARN y ADN.

La obtención de estas biomoléculas a partir de tales muestras biológicas fijadas, embebidas en parafina, es sin embargo costosa y complicada, puesto que las muestras tienen que ser en primer lugar liberadas de la parafina que las rodea. En el caso de las muestras se trata usualmente de unos cortes delgados, cuya proporción de parafina sobrepasa por regla general manifiestamente a la proporción de la muestra. Puesto que la parafina puede perturbar en el caso de la elaboración ulterior de la muestra y del aislamiento de las biomoléculas, o puede reprimirla/o totalmente, en el estado de la técnica se proponen diferentes modos de proceder, por medio de los cuales se puede separar la parafina.

En el documento de solicitud de patente internacional WO 2006/039563 se propone tratar previamente a la muestra biológica después del corte, por ejemplo con un microtomo, con xileno, tolueno, isoparafina o limoneno, con el fin de disolver a la parafina. Esta solución se centrifuga a continuación, el disolvente se elimina y la muestra se lava eventualmente con etanol, con el fin de eliminar los restos de disolvente posiblemente presentes. A continuación, la muestra se seca y luego se somete al análisis ulterior.

Las múltiples etapas de lavado con etanol, necesarias para la obtención de un material de muestra limpio, son, por una parte, costosas, y además de esto albergan el peligro de que después de la separación por centrifugación, al retirar el material sobrenadante de etanol, ya sean conjuntamente eliminadas por descuido partes del material de la muestra. La misma problemática se establece en el caso de la centrifugación y la retirada del disolvente para la parafina. Esto es particularmente problemático cuando, está a disposición sólo poca cantidad del material de la muestra, porque entonces el material de la muestra apenas es reconocible a simple vista en el disolvente. Puesto que una elaboración limpia de la muestra por medio de este procedimiento requiere mucha habilidad y sobre todo experiencia, apenas es posible realizar una automatización confiable.

En el documento de patente de los EE.UU. US 2007/0026432 se describe otro procedimiento para el análisis de muestras biológicas fijadas, embebidas en parafina. Para esto se propone calentar el material de la muestra, embebido en parafina, después de una adición de detergentes, por encima del punto de fusión de la parafina, y dejar a la muestra a continuación enfriarse otra vez por debajo del punto de ebullición de la parafina. La obtención del material de la muestra se efectúa entonces con ayuda de una cánula, que es conducida a través de la capa solidificada de parafina hacia el material de la muestra, que se encuentra situado debajo de ésta. En el caso de este procedimiento es desventajoso el hecho de que, al perforar la capa de parafina, la cánula pueda ser obstruida por la parafina, lo que hace prácticamente imposible una automatización.

A partir del documento de patente europea EP 1 743 939 y del documento de solicitud de patente internacional WO 01/46402 A1 se conoce asimismo un procedimiento para realizar la desparafinación de muestras biológicas. En este documento se propone disolver la parafina con ayuda de unos disolventes apropiados tales como benceno, tolueno, etilbenceno, xileno o mezclas de éstos, y separarla mediante centrifugación, realizándose que el sedimento obtenido al realizar la centrifugación se lava a continuación múltiples veces con un disolvente adecuado, con el fin de eliminar la parafina lo más completamente que sea posible.

A partir del artículo "Inter-laborator y validation of PCR-based detection of Mycobacterium tuberculosis in formalinfixed, paraffin-embedded tissues" (Validación entre laboratorios de una detección basada en una PCR de Mycobacterium tuberculosis en tejidos fijados en formalina, embebidos en parafina) , Christiane Schewe y colaboradores, Virchows Archiv, Springer, Berlin, tomo 447, n° 3, septiembre de 2005, páginas 573-585, se conoce un procedimiento para la realización de una reacción de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) en presencia de un ADN procedente de muestras embebidas en parafina. En este caso, las muestras se reúnen primeramente con xileno, con el fin de disolver a la parafina, a continuación se centrifugan, el material sobrenadante se desecha y el sedimento obtenido se lava con etanol. Tanto la extracción con xileno como también las etapas de lavado con etanol se pueden llevar a cabo una vez o múltiples veces.

A partir del artículo "Comparison of the DNA extraction methods for polymerase chain reaction amplification from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues" (Comparación de los métodos de extracción del ADN para la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa a partir de tejidos fijados con formalina y embebidos en parafina) de Sato y colaboradores, Diagnostic molecular pathology, Nueva York, tomo 10, n° 4, diciembre de 2011, páginas 265-271, se conoce un procedimiento análogo a ellos para la eliminación de la parafina a partir de muestras embebidas en parafina, en el que asimismo la parafina se elimina primeramente con xileno, a continuación se centrifuga, el material sobrenadante se desecha, y el sedimento obtenido al realizar la centrifugación se lava una vez

o múltiples veces con etanol para la eliminación del xileno.

A partir del documento WO 2006/130632 A2 se conoce un procedimiento para el aislamiento de biomoléculas a partir de una muestra biológica fijada, embebida en parafina. En el caso del procedimiento aquí descrito, la muestra que se ha de analizar se calienta primeramente a 50 hasta 85°C durante aproximadamente un minuto hasta sesenta minutos en presencia de un tampón iónico que contiene detergentes. En este caso se forma una mezcla de dos fases. El aislamiento de las biomoléculas se efectúa a continuación a partir de la fase acuosa.

En el artículo "Real-Time PCR analysis of DNA and RNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded biopsies" (Análisis por PCR en tiempo real de los ADN y ARN extraídos a partir de biopsias fijadas con formalina y embebidas en parafina) de Lehmann y colaboradores, Methods (San Diego) , diciembre de 2011, tomo 25, n° 4, diciembre de 2001, páginas 409-418, se describe un procedimiento para el aislamiento de un ARN a partir de muestras fijadas con formalina y embebidas en parafina. En este caso, las muestras se calientan primeramente a 55°C durante una noche en presencia de una mezcla de un detergente iónico y una proteasa, y luego se ponen en contacto con una solución acuosa y/o con agua, con lo que se forma una mezcla de dos fases, efectuándose a continuación el aislamiento de las biomoléculas a partir de la fase acuosa. También en este caso, mediante el calentamiento en presencia del tampón que contiene el detergente, la parafina se vuelve líquida... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para el aislamiento de biomoléculas a partir de una muestra biológica fijada, embebida en parafina, que comprende las etapas de:

poner en contacto la muestra

a) con un disolvente no miscible con agua y disolver la parafina en este disolvente mediando formación de una fase orgánica líquida, y

b) con una solución acuosa de por lo menos una sustancia para lisis y/o con agua y por lo menos una sustancia para lisis mediando formación de una fase acuosa,

formándose por medio de las etapas a) y b) una mezcla de dos fases; y seguidamente

aislar las biomoléculas a partir de la fase acuosa.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa a) se lleva a cabo antes de, después de o al mismo tiempo que la etapa b) .

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el disolvente no miscible con agua tiene una densidad más pequeña que la del agua y/o el disolvente no miscible con agua es líquido a ≤ 25°C, en particular a ≤ 20°C.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el disolvente no miscible con agua se escoge entre compuestos hidrocarbonados aromáticos con 6 hasta 30 átomos de carbono, compuestos hidrocarbonados alifáticos con 10 hasta 30 átomos de carbono, ácidos alcanoicos o alquenoicos con 2 hasta 20 átomos de carbono y sus derivados, alcoholes aromáticos o alifáticos con 6 hasta 12 átomos de carbono, así como mezclas de éstos.

5. Procedimiento de acuerdo con unas de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el disolvente no miscible con agua tiene un punto de ebullición bajo una presión normal de por lo menos 150°C, en particular de por lo menos 160°C y/o el disolvente no miscible con agua tiene un punto de inflamación de por lo menos 40°C, en particular de por lo menos 50°C y/o tiene un valor de KOW de por lo menos 4, en particular de por lo menos 5.

6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las biomoléculas se escogen entre proteínas, ácidos nucleicos, en particular entre ácidos nucleicos mono-o bicatenarios.

7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la sustancia para lisis se escoge entre enzimas y/o sales caotrópicas.

8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque en la etapa b) se añaden además todavía

● por lo menos una sustancia tamponadora y/o

● por lo menos un alcohol que tiene de uno hasta cuatro átomos de carbono y/o

● por lo menos un agente de reducción y/o

● por lo menos un tampón y/o un reactivo para suprimir los enlaces covalentes y/o las modificaciones de la biomolécula, que se han provocado por el tratamiento con formalina.

9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la disolución de la parafina se lleva a cabo mediando calentamiento, en particular a una temperatura de 35 a 70°C y/o la etapa b) del procedimiento se lleva a cabo mediando calentamiento, en particular a una temperatura de 70 a 100°C.

10. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el aislamiento de las biomoléculas a partir de la fase acuosa se lleva a cabo mediante una deposición de las biomoléculas junto a una fase sólida, que es en particular una columna cromatográfica, en caso deseado seguida por una o varias etapas de lavado, en particular para la deposición de las biomoléculas junto a la fase sólida, se ponen en contacto la fase acuosa totalmente, y la fase orgánica por lo menos parcialmente con la fase sólida.

11. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la fase acuosa y/o la fase orgánica están amplísimamente exentas de agentes tensioactivos, en particular de agentes tensioactivos aniónicos, catiónicos y/o anfóteros.

Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4