Clasificación eficiente de células haploides por sistemas de citometría de flujo.

Un método de procesamiento de muestras por citometría de flujo,

que comprende las etapas de:

el establecimiento de al menos un fluido (3) envolvente;

el flujo de dicho al menos un fluido envolvente en al menos dos boquillas (5);

la inyección de al menos una muestra que puede ser irradiada en dicho al menos un fluido envolvente;

la utilización de al menos un recurso compartido para procesar de dicha al menos una muestra que puede ser irradiada, en el que dicho al menos un recurso compartido incluye una fuente (12) de radiación;

sometimiento de dicha muestra que puede ser irradiada de dichas al menos dos boquillas a radiación a partir de dicha fuente (12) de radiación ;

excitación de dicha muestra que puede ser irradiada de dichas al menos dos boquillas con dicha radiación a partir de dicha fuente (12) de radiación ;

emisión de fluorescencia a partir de dicha muestra excitada;

detectar una cantidad de dicha fluorescencia emitida desde cada partícula en dicha muestra;

evaluar dicha cantidad de fluorescencia emitida desde cada partícula en dicha muestra;

seleccionar una condición eléctrica que se asocia con cada partícula de dicha muestra en dicho flujo de fluido envolvente; cargar una corriente de dicha muestra que puede ser irradiada y fluido envolvente con base en las propiedades deducidas de cada partícula de dicha muestra en dicho flujo de fluido envolvente;

la formación de una gota (9) cargada;

aislar dicha gota cargada de dicho flujo de fluido envolvente;

la deflexión de dichas gotas (9) cargadas;

la clasificación de dicha muestra; y

la recolección de dicha muestra clasificada, en donde dicha etapa de inyectar al menos una muestra que puede ser irradiada en dicho al menos un fluido envolvente comprende la etapa de inyectar células espermáticas teñidas con Hoechst 33342 en dicho al menos un fluido envolvente y en donde la fuente (12) de radiación es un láser pulsado que suministra de 100 a 500 mW de energía.

Clasificación eficiente de células haploides por sistemas de citometría de flujo

Campo de la invención 5

La presente invención se refiere a un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo. Más específicamente, la invención se refiere al uso de un láser pulsado en un sistema de flujo para el análisis de partículas que se traduce en una cuantificación más precisa de las propiedades medibles de las partículas individuales. Puede ser de particular interés en el análisis de poblaciones de partículas muy similares, a altas 10 velocidades, lo que permite una separación más eficiente de las partículas en dos o más poblaciones diferentes. La invención es particularmente útil en la aplicación de la separación de esperma en vivo que transporta al cromosoma X y al cromosoma Y de todos los mamíferos a velocidades más altas, mejor grado de pureza y con resultados iguales o mejores en la salud del esperma, es decir, con menos daño para el esperma. La invención puede contribuir a lograr mejoras significativas a la economía de la clasificación del esperma. 15

II. Antecedentes de la invención

Los láseres pueden ser utilizados para suministrar luz a partículas biológicas o no biológicas y los espectros de emisión se pueden utilizar para el análisis de características de las partículas. En algunos casos, esto se puede 20 aplicar por ejemplo donde una partícula es en sí misma fluorescente o por sí misma absorbe color, está asociada por afinidad, avidez, enlaces covalentes, o bien a otra molécula que puede ser coloreada o fluorescente, puede estar asociada a otra molécula que es coloreada o fluorescente a través de una interacción macromolecular biológica o modelada específica, tal como un evento de enlazamiento a un anticuerpo o un oligómero de ácido nucleico o un evento de hibridación de ácido polinucleico, puede obtener color o fluorescencia, tal como a través de un evento de 25 síntesis enzimática, una unión enzimática o reacción de escisión, conversión enzimática de un sustrato, la asociación de una molécula fluorescente con un inactivador cercano, la reacción de un producto en ciertas concentraciones de protón local (pH) o NADH o NADPH o ATP o hidruro libre (H-) o hidruro enlazado R- (H-) concentraciones, o puede ganar color o fluorescencia por medio de una variedad de métodos para asociar luz emitida o absorbida (radiación electromagnética, REM) . 30

Los láseres convencionales pueden generar una fuente de luz fuerte, tal vez intensa. A través de las propiedades de coherencia del haz tal luz puede viajar distancias muy largas, tal vez a través de espejos reflectantes que pueden cambiar el ángulo del haz de iluminación de luz, quizás a través de prismas u objetos refractantes o lentes que pueden dividir el haz en dos o más haces de igual o diferente intensidad, o pueden desenfocar, tal vez expandir, o 35 enfocar, quizás concentrar, el haz. Tal luz también puede verse afectada por filtros que pueden reducir la energía neta del haz. La mayoría de los láseres también permiten la modulación de la intensidad de la luz, tal vez vatios, en el haz mediante el ajuste de una corriente de entrada desde una fuente de alimentación hacia el elemento generador de luz.

En algunas aplicaciones, los láseres convencionales utilizados en el análisis y la cuantificación de los objetos biológicos pueden combinarse con detectores de luz sensibles que pueden ser tan simples, tales como una película fotográfica o papel, o pueden ser más complejos, tales como un tubo fotomultiplicador. A menudo, un detector de luz puede recopilar sólo información sobre una cantidad acumulada de luz, tal vez radiación electromagnética, REM, o puede recopilar e informar sobre los cambios dinámicos en la intensidad de la luz o REM que incide en todas o en 45 partes de regiones localizadas, o posiciones sobre la superficie del detector. El detector de luz también puede implicar el uso de un dispositivo de acoplamiento fotoeléctrico, que puede permitir que la energía de los fotones absorbidos en la REM por el detector de luz se convierta en una corriente proporcional a la luz incidente o REM sobre la superficie del detector de luz. El dispositivo de acoplamiento fotoeléctrico incluso puede estar integrado en un circuito electrónico con un amplificador que puede aumentar la señal o crear ganancia de tal forma que las 50 fluctuaciones o quizás la suma de la corriente amplificada puede estar disponible para un circuito lógico análogo o digital. Los diseños también pueden transmitir una señal o conjunto de datos a un usuario de un instrumento de análisis de partículas y esta señal puede ser proporcional a la intensidad estática, acumulativa, o tal vez incluso dinámica de la luz o REM incidente sobre el detector.

En ciertos usos de la luz láser para analizar partículas biológicas, un detector puede medir el cambio en la intensidad de la fuente de luz después de la incidencia sobre una (s) partícula (s) que es analizado usando un haz de referencia que toma un camino sin incidir sobre la (s) partícula (s) . En otros usos de la luz láser, partículas modificadas o no modificadas absorben una fracción de la luz de iluminación o REM y pueden emitir luz de una frecuencia diferente. En muchos casos, la presencia de luz de emisión o REM de una cierta longitud de onda se puede utilizar para 60 identificar o cuantificar características asociadas con partículas específicas, o medir cuantitativamente la cantidad o el número de las partículas biológicas específicas presentes en la muestra o en una región específica o posición en la muestra.

En algunos casos, puede ser útil determinar con precisión diferencias muy pequeñas en la luz de iluminación o en la 65 luz de emisión de dos partículas biológicas muy similares (por ejemplo una célula de esperma que porta el cromosoma X en comparación con una célula de esperma que porta el cromosoma Y) . Estas pequeñas diferencias pueden ser analizadas por medio de la presentación en serie de tal vez 50.000 eventos de emisión separados por segundo en una corriente de líquido. Estas también pueden ser miles de emisiones separadas de moléculas (por ejemplo, ácidos nucleicos o proteínas) en un campo de matriz que permite el análisis de bibliotecas genética, genómica, proteómica, o glicómica. 5

El tipo tradicional de láser utilizado para el análisis de partículas en citometría de flujo es un láser de onda continua (OC) . A menudo, este proporciona un haz de intensidad constante. Sin embargo, en algunos casos, los láseres de OC pueden tener desventajas particulares para aplicaciones como se discute aquí. El haz puede dar lugar a la modificación o destrucción de la muestra que está siendo observada. Por ejemplo, con respecto a las células 10 espermáticas, la irradiación puede resultar en una menor fertilidad de los espermatozoides. En segundo lugar, en algunos casos cuando el rayo láser opera de forma continua, puede ser deseable tener un método de interrumpir el haz si se mueve desde un primer sitio de incidencia a un segundo sitio de incidencia sin iluminación de las zonas intermedias.

En la patente de los Estados Unidos No. 5.596.401 de Kusuzawa, se puede utilizar un láser pulsado para obtener imágenes de un objeto, tal como una célula, en un citómetro de flujo. Esta divulgación puede estar relacionada con mejoras en la captura de imágenes de partículas tales como las modulaciones de reducción de la coherencia. Kusuzawa puede enseñar el uso de un láser de onda continua para la detección de partículas y la formación de imágenes. 20

En la patente de los Estados Unidos No. 5.895.922 y la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2003/0098421 de Ho, se puede utilizar la luz láser pulsado para iluminar y detectar partículas biológicas peligrosas dispersas en una corriente de flujo de aire. La invención puede incluir una luz láser ultravioleta y la búsqueda de la emisión de fluorescencia de partículas biológicas potencialmente peligrosas. Esta divulgación puede enseñar las 25 desventajas de un aparato de diodo láser.

La patente de los Estados Unidos No. 6.177.277 de Soini, describe el empleo de una configuración óptima de excitación de dos fotones y/o confocal. La invención puede referirse a la utilización de la óptica confocal para reducir el volumen de análisis hasta aproximadamente 10% del volumen de análisis estándar en un citómetro de flujo. Un 30 láser pulsado puede proporcionar pulsos cortos de luz intensa y puede permitir la absorción simultánea de dos fotones de modo que la longitud de onda del haz de luz de iluminación puede ser más larga que una ráfaga emitida de fotones individuales. Se puede reducir la señal de fondo mediante... [Seguir leyendo]

1. Un método de procesamiento de muestras por citometría de flujo, que comprende las etapas de:

el establecimiento de al menos un fluido (3) envolvente; 5

el flujo de dicho al menos un fluido envolvente en al menos dos boquillas (5) ;

la inyección de al menos una muestra que puede ser irradiada en dicho al menos un fluido envolvente;

la utilización de al menos un recurso compartido para procesar de dicha al menos una muestra que puede ser irradiada, en el que dicho al menos un recurso compartido incluye una fuente (12) de radiación;

sometimiento de dicha muestra que puede ser irradiada de dichas al menos dos boquillas a radiación a partir de 10 dicha fuente (12) de radiación ;

excitación de dicha muestra que puede ser irradiada de dichas al menos dos boquillas con dicha radiación a partir de dicha fuente (12) de radiación ;

emisión de fluorescencia a partir de dicha muestra excitada;

detectar una cantidad de dicha fluorescencia emitida desde cada partícula en dicha muestra; 15

evaluar dicha cantidad de fluorescencia emitida desde cada partícula en dicha muestra;

seleccionar una condición eléctrica que se asocia con cada partícula de dicha muestra en dicho flujo de fluido envolvente;

cargar una corriente de dicha muestra que puede ser irradiada y fluido envolvente con base en las propiedades deducidas de cada partícula de dicha muestra en dicho flujo de fluido envolvente; 20

la formación de una gota (9) cargada;

aislar dicha gota cargada de dicho flujo de fluido envolvente;

la deflexión de dichas gotas (9) cargadas;

la clasificación de dicha muestra; y la recolección de dicha muestra clasificada, en donde dicha etapa de inyectar al menos una muestra que puede ser 25 irradiada en dicho al menos un fluido envolvente comprende la etapa de inyectar células espermáticas teñidas con Hoechst 33342 en dicho al menos un fluido envolvente y en donde la fuente (12) de radiación es un láser pulsado que suministra de 100 a 500 mW de energía.

2. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además la etapa de dividir dicha radiación en al menos dos haces de luz. 30

3. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicha etapa de dividir dicha radiación en al menos dos haces de luz comprende la etapa de someter dicha muestra que puede ser irradiada con una potencia reducida de radiación que la que fue emitida originalmente desde una fuente de láser. 35

4. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 3 en donde dicho paso de someter dicha muestra que puede ser irradiada con una potencia reducida de radiación que la que fue originalmente emitida desde una fuente de láser comprende la etapa de seleccionar dicha potencia reducida de un grupo que consiste de la mitad, un cuatro, y un octavo de dicha potencia emitida originalmente. 40

5. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 1 en donde dicha etapa de detectar una cantidad de dicha fluorescencia emitida desde cada partícula en dicha muestra comprende la etapa de detectar cuantitativamente una cantidad de dicha fluorescencia emitida desde cada partícula en dicha muestra. 45

6. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 5 en donde la etapa de inyectar al menos unas células espermáticas que pueden ser irradiadas en dicho al menos un fluido envolvente y en donde dicha etapa de detectar cuantitativamente una cantidad de dicha fluorescencia emitida desde cada partícula en dicha muestra comprende distinguir entre esperma que contiene al cromosoma X y esperma que contiene al cromosoma Y en donde dicho esperma que contiene al cromosoma X emite una fluorescencia diferente 5 que dicho esperma que contiene al cromosoma Y.

7. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende además la etapa de utilizar un manipulador (21) del haz.

8. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 1 en donde dicha etapa de utilizar un manipulador (21) del haz comprende la etapa de utilizar un manipulador del haz seleccionado de un grupo que consiste en espejos, deflectores, divisores del haz, prismas, objetos de refracción, lentes y filtros.

9. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 1 en donde dicha etapa de coloración de dicha muestra comprende la etapa de tinción de dicha muestra durante un tiempo de coloración reducido.

10. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 9, en 20 donde dicha etapa de tinción durante un tiempo reducido comprende la etapa de teñir dicha muestra durante menos de aproximadamente 40 minutos.

11. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 9 en donde dicho tiempo de tinción reducido se selecciona de entre un grupo que consiste de 25

- menos de aproximadamente 35 minutos;

- menos de aproximadamente 30 minutos;

- menos de aproximadamente 25 minutos;

- menos de aproximadamente 20 minutos; 30

- menos de aproximadamente 15 minutos;

- menos de aproximadamente 10 minutos; y - menos de aproximadamente 5 minutos.

12. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 1 en donde dicha etapa de recolección de dicha muestra clasificada comprende la etapa de recolectar al menos dos poblaciones 35 de partículas de la muestra.

13. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 12 en donde dicha etapa de recolección de al menos dos poblaciones de partículas de la muestra comprende la etapa de recolección de una población clasificada de esperma que contiene al cromosoma X y la recolección de una 40 población clasificada de esperma que contiene al cromosoma Y.

14. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 12 en donde dicha etapa de recolección de al menos dos poblaciones de partículas de la muestra comprende la etapa de recolección de dichas poblaciones con una alta velocidad de recolección. 45

15. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 14 en donde dicha alta velocidad de recolección se selecciona de entre un grupo que consiste de:

- superior a 2.400 partículas por segundo; 50

- superior a 2.600 partículas por segundo;

- superior a 2.900 partículas por segundo;

- superior a 3.000 partículas por segundo; y - superior a 3.100 partículas por segundo.

16. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 1 en donde dicha etapa de detectar una cantidad de dicha fluorescencia emitida desde cada partícula en dicha muestra comprende la etapa de detectar a una velocidad de eventos de entre aproximadamente 10.000 hasta aproximadamente 60.000 partículas por segundo. 5

17. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 1 en donde dicha etapa de someter dicha muestra que puede ser irradiada a radiación comprende la etapa de iniciar una rutina de detección.

18. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 1 en donde el láser pulsado suministra pulsos entre 5 a 20 picosegundos.

19. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 18 en donde el periodo de emisión de pulsos está entre 0, 5 a 20 nanosegundos. 15

20. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 19 que comprende además proporcionar una velocidad de repetición entre aproximadamente 2 hasta 10 microsegundos.

21. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 20 en 20 donde dicha etapa de proporcionar una velocidad de repetición comprende la etapa que proporciona una velocidad de repetición de entr.

5. 200 MHz.

22. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 1 en donde dicha etapa de tinción de dicha muestra con Hoechst 33342 comprende la etapa de teñir mínimamente dichas 25 muestras con Hoechst 33342.

23. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 22 en donde dicha etapa de teñir mínimamente las muestras con Hoechst 33342 comprende la etapa de permitir que menos colorante se una a dicha muestra. 30

24. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 22 o 23, en donde dicha etapa de teñir mínimamente dichas muestras con Hoechst 33342 comprende la etapa de proporcionar un porcentaje de Hoechst 33342 seleccionado de entre el grupo que consiste de aproximadamente el 90%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 70%, y aproximadamente el 60% de una coloración máxima. 35

25. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 1 en donde dicha etapa de inyectar al menos una muestra que puede ser irradiada dentro de dicho al menos un fluido envolvente que comprende inyectar células espermáticas seleccionadas de entre el grupo que consiste de células espermáticas de mamíferos bovinos, células espermáticas de equino, células espermáticas de porcinos, células 40 espermáticas de ovinos, células espermáticas de camélidos, células espermáticas rumiantes, y las células espermáticas canina.

26. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 1 en donde dicha etapa de recolectar dicha muestra clasificada comprende la etapa de recolectar dicha muestra clasificada en 45 un recolector, en donde dicho recolector se selecciona de entre el grupo que consiste de múltiples contenedores (32) y un recolector (63) combinado que tiene contenedores (32; 33; 64) . individuales

27. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 26 que comprende además la etapa de proporcionar una cantidad de contenedores (32) seleccionados menor que la 50 cantidad de boquillas.

28. Un método de procesamiento de una muestra por citometría de flujo de acuerdo con la reivindicación 1 en donde dicha etapa de utilizar un láser pulsado comprende la utilización de un láser pulsado seleccionado de entre un grupo que consiste de Nd:YAG y Nd:YVO4. 55