Método de crioconservación de espermatozoides seleccionados.

Un método para la crioconservación de espermatozoides bovinos seleccionados por sexo que comprende:

(a) obtener una muestra de semen bovino;

(b) agregarle un extensor inicial y seleccionar el semen por sexo mediante citometría de flujo;

(c) enfriar dicha muestra de semen seleccionado;

(d) aislar por centrifugación los espermatozoides de dicha muestra de semen seleccionado fría paraproducir espermatozoides aislados fríos;

(e) agregar un extensor final a dichos espermatozoides aislados fríos para producir una suspensión deespermatozoides fría, en la cual el extensor final contiene un crioprotector, Tris[hidroximetil]aminometano yácido cítrico; y

(f) congelar dicha suspensión de espermatozoides.

Método de crioconservación de espermatozoides seleccionados Campo de la invención La invención se refiere a un método para congelar espermatozoides seleccionados por sexo.

Antecedentes de la invención Más de medio siglo atrás, se introdujo la inseminación artificial en los Estados Unidos como una herramienta de cría comercial para una gran diversidad de especies de mamíferos. Aunque la inseminación artificial estuvo limitada inicialmente a regiones relativamente próximas al sitio de recolección de los espermatozoides, los avances en la crioconservación y el almacenamiento de los espermatozoides han facilitado la amplia distribución y comercialización de espermatozoides para inseminación artificial o fertilización in vitro.

Otras mejoras en la recolección, la selección, la crioconservación, el almacenamiento y las técnicas de manipulación de los espermatozoides de mamíferos han mejorado la capacidad de los criadores para producir animales que tengan las características deseadas. Por ejemplo, los avances en la selección de los espermatozoides de mamíferos basada en pequeñas diferencias en las características físicas ha hecho posible separar los espermatozoides según el tipo de sexo, es decir, seleccionar los espermatozoides que contienen el cromosoma X o el Y. Esta técnica permite al criador manipular el porcentaje relativo de espermatozoides tipo X o Y en una muestra y así determinar el sexo de las crías. La capacidad para seleccionar los espermatozoides basándose en el tipo de sexo o cualquier otra característica deseable proporciona una herramienta importante para acelerar el progreso genético, aumentar la eficiencia de la producción y lograr mayor flexibilidad en el manejo del ganado. La explotación total de esta herramienta, sin embargo, depende de la capacidad de congelar y almacenar los espermatozoides seleccionados.

Se dispone de varios métodos para seleccionar espermatozoides; sin embargo, la selección y el tratamiento posterior de los espermatozoides presenta desafíos únicos debido a que éstos son incapaces de reparar el ADN y a la morfología espermática. Cada espermatozoide tiene un acrosoma que cubre la cabeza y una cola, que son importantes para la fertilidad y que son relativamente propensas a sufrir daño físico. Además, la fertilidad de los espermatozoides disminuye al aumentar el tiempo entre la recolección y el uso. Como la mayoría de los métodos de selección disponibles implican estrés físico e insumen tiempo, los espermatozoides seleccionados están habitualmente un poco deteriorados en comparación con los no seleccionados. La fertilidad se puede reducir aún más si la técnica de selección implica una dilución importante. Se ha sugerido que este "efecto de dilución" se puede deber a la pérdida de componentes protectores del plasma seminal.

La citometría de flujo es un método de selección particularmente eficaz que se ha empleado para la clasificación de espermatozoides por tipo de sexo. Sin embargo, los espermatozoides clasificados están sometidos a mayor estrés que el estrés normal de los protocolos estándar de inseminación artificial o fertilización in vitro. En particular, la citometría de flujo demanda mucho tiempo y, debido a las limitaciones físicas de los citómetros de flujo, los espermatozoides se deben diluir para la clasificación hasta niveles que no son óptimos para el almacenamiento (generalmente hasta el orden de 105-106/ml) . Además, los espermatozoides clasificados para inseminación artificial se deben concentrar para que se puedan utilizar equipos de acondicionamiento y distribución convencionales. La necesidad de un paso de concentración expone así a los espermatozoides ya algo deteriorados a estrés físico adicional.

El congelamiento de los espermatozoides también reduce invariablemente su fertilidad, movilidad y/o viabilidad. Seidel et al (1999) Theriogenology, vol. 51, número 1, página 400 describe una técnica para la crioconservación de espermatozoides seleccionados por sexo.

Resumen La presente invención proporciona un método para la crioconservación de espermatozoides bovinos seleccionados por sexo que comprende:

(a) obtener una muestra de semen bovino;

(b) agregarle un extensor inicial y seleccionar el semen por sexo mediante citometría de flujo;

(c) enfriar dicha muestra de semen seleccionado;

(d) aislar por centrifugación los espermatozoides de dicha muestra de semen seleccionado fría para producir espermatozoides aislados fríos;

(e) agregar un extensor final a dichos espermatozoides aislados fríos para producir una suspensión de espermatozoides fría, en la cual el extensor final contiene un crioprotector y Tris[hidroximetil]aminometano; y

(f) congelar dicha suspensión de espermatozoides.

La presente divulgación también proporciona una muestra de espermatozoides bovinos congelados que han sido seleccionados por tipo de sexo.

La muestra de espermatozoides seleccionados congelados se puede utilizar en diversas aplicaciones. En particular, la muestra se puede descongelar y utilizar para la fertilización. Por consiguiente, la divulgación también incluye un método de uso de la muestra de espermatozoides seleccionados congelados para inseminación artificial o fertilización in vitro.

Descripción detallada de la invención La presente invención permite la crioconservación de espermatozoides bovinos que han sido seleccionados por tipo de sexo, facilitando el almacenamiento o el envío de muestras de espermatozoides seleccionados a sitios distantes del punto de recolección. El descongelamiento produce espermatozoides viables que se pueden utilizar en procedimientos como la inseminación artificial ("IA") y la fertilización in vitro ("FIV") . Este resultado fue sorprendente debido a la fragilidad bien documentada de los espermatozoides. Investigadores anteriores habían demostrado que el estrés asociado a varios métodos de selección o a la crioconservación provocaba pérdidas significativas en la fertilidad y/o la viabilidad. Los inventores de la presente demostraron que se puede lograr la preñez con espermatozoides seleccionados y luego congelados.

La invención representa un avance importante en el manejo de ganado bovino, donde la selección de los espermatozoides para su uso en dichos procedimientos se puede utilizar para aumentar la producción de crías que tengan características deseables. La selección para obtener espermatozoides que tengan el cromosoma X o el Y permite controlar el sexo de las crías, lo cual es ventajoso para los productores de ganado lechero o de carne. La capacidad de congelar espermatozoides seleccionados, que proporciona la invención, permitirá el uso generalizado de dichos métodos de selección, por ejemplo, para aumentar la eficiencia en la producción así como en la calidad del ganado bovino.

Definiciones El término "acrosoma" o "gorra acrosómica" se refiere a la gorra que cubre la mitad anterior de la cabeza del espermatozoide y que contiene las enzimas necesarias para la penetración del óvulo.

La expresión "tipo de sexo" se refiere al tipo de cromosoma sexual presente en los espermatozoides (es decir, el cromosoma X o el Y) .

El término "capacitación" se refiere a los cambios específicos que experimenta un espermatozoide para desarrollar la capacidad de fertilizar óvulos, tales como cambios enzimáticos en la superficie del acrosoma que conducen a la liberación de enzimas acrosómicas que facilitan la penetración del espermatozoide en el óvulo.

Según se usa en referencia a los espermatozoides, el término "crioprotector" se refiere a una molécula que protege a los espermatozoides durante el ciclo de congelación y descongelación, promoviendo la supervivencia y la retención de la capacidad de fertilización.

La expresión "efecto de dilución" se refiere a la rápida disminución en la movilidad y viabilidad de los espermatozoides cuando están muy diluidos.

Según se usa en este documento, el término "selección" se refiere a un método por el cual se subdivide una muestra basándose en la presencia o ausencia de una característica específica (a menos que el contexto imponga lo contrario) . Por lo tanto, una "muestra de espermatozoides seleccionados" es una muestra obtenida sometiendo a selección una muestra original en función de la característica específica. Por lo tanto, una muestra de espermatozoides seleccionados está enriquecida, en relación con la muestra original, en espermatozoides que tienen la característica específica.

El término "clasificación" se usa en este documento para describir un método de selección llevado a cabo usando un clasificador de células activadas por fluorescencia... [Seguir leyendo]

1. Un método para la crioconservación de espermatozoides bovinos seleccionados por sexo que comprende:

(a) obtener una muestra de semen bovino;

(b) agregarle un extensor inicial y seleccionar el semen por sexo mediante citometría de flujo;

(c) enfriar dicha muestra de semen seleccionado;

(d) aislar por centrifugación los espermatozoides de dicha muestra de semen seleccionado fría para producir espermatozoides aislados fríos;

(e) agregar un extensor final a dichos espermatozoides aislados fríos para producir una suspensión de espermatozoides fría, en la cual el extensor final contiene un crioprotector, Tris[hidroximetil]aminometano y ácido cítrico; y

(f) congelar dicha suspensión de espermatozoides.

2. El método de la reivindicación 1 donde el enfriamiento se lleva a cabo reduciendo la temperatura de la muestra de semen seleccionado hasta aproximadamente 5 °C.

3. El método de la reivindicación 2 donde el enfriamiento se lleva a cabo en un período entre aproximadamente 60

minutos y aproximadamente 240 minutos. 20

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el extensor final agregado a dicha muestra de espermatozoides seleccionados contiene además uno o más de los componentes siguientes: una sustancia orgánica que reduce el choque por frío y mantiene la fertilidad de los espermatozoides, una fuente de energía, una sustancia que facilita la capacitación de los espermatozoides y un antibiótico.

5. El método de la reivindicación 4 donde dicho crioprotector se elige del grupo que consiste en disacáridos, trisacáridos y cualquiera de sus combinaciones.

6. El método de la reivindicación 4 donde dicho crioprotector se elige del grupo que consiste en glicerol, 30 dimetilsulfóxido, etilenglicol, propilenglicol y cualquiera de sus combinaciones.

7. El método de la reivindicación 4 donde dicha sustancia orgánica se elige del grupo que consiste en yema de huevo, un extracto de yema de huevo, leche, un extracto de leche, caseína, albúmina, lecitina y cualquiera de sus combinaciones.

8. El método de la reivindicación 4 donde dicha fuente de energía es un monosacárido que se elige del grupo que consiste en glucosa, fructosa, manosa y cualquiera de sus combinaciones.

9. El método de la reivindicación 4 donde dicho antibiótico se elige del grupo que consiste en tilosina, gentamicina, 40 lincomicina, linco-espectina, espectinomicina, penicilina, estreptomicina y cualquiera de sus combinaciones.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde, después de la adición del extensor final, la muestra de semen y la suspensión de espermatozoides, respectivamente, contienen glicerol, citrato de sodio, Tris[hidroximetil]aminometano, yema de huevo, fructosa y uno o más antibióticos.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde dicho extensor final tiene un pH en el rango de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde dicha centrifugación permite la recuperación 50 de al menos aproximadamente 50% a aproximadamente 90% de los espermatozoides.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la concentración de espermatozoides en dicha suspensión antes de la congelación es de aproximadamente 1 x 106/ml a aproximadamente 300 x 106/ml.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde los espermatozoides se seleccionan por citometría de flujo en el paso (b) de modo de producir una muestra de semen seleccionado que incluya una fracción A de un extensor que carezca de glicerol, y donde una fracción B que contiene glicerol se agrega a la muestra de semen seleccionado antes del aislamiento del paso (d) .