Boquilla de citómetro de flujo.

Un sistema de citómetro de flujo, que comprende:

a. un tubo de inyección de muestras (3) que tiene un punto de inyección a través del que se puede introducir unamuestra,

b. un recipiente de fluido envolvente (1) que tiene un extremo inferior y en el que dicho tubo de inyección de muestras(3) está localizado dentro de dicho recipiente de fluido envolvente (1),

c. una vía de acceso de fluido envolvente conectada a dicho recipiente de fluido envolvente (1),

d. una boquilla de una sola orientación torsional (6) localizada al menos en parte debajo de dicho punto de inyección, y

e. un sistema analítico que detecta por debajo de dicha boquilla de una sola orientación torsional (6);

en el que dicha boquilla de una sola orientación torsional (6) comprende un elemento de una sola superficie interiortorsional que tiene un elemento de una sola superficie interior torsional, elipsoidal ahusado, que está dividido en unazona interior elíptica ahusada (c) y una zona interior cilíndrica (d) y en el que la zona interior elíptica ahusada (c) estáconectada directamente a la zona interior cilíndrica (d) y un orificio circular de salida (15) de la boquilla (6).

Boquilla de citómetro de flujo

I. Campo técnico Esta invención se refiere a un sistema mejorado de citómetro de flujo. Específicamente, esta invención se refiere a un diseño novedoso de una geometría de una superficie interior de una boquilla que manipula con cuidado y orienta una muestra en una dirección radial apropiada para un análisis y una clasificación eficaz. La presente invención también se centra en un procedimiento para clasificar células delicadas, especialmente espermatozoides vivos.

II. Antecedentes Los citómetros de flujo han tenido un uso clínico y de investigación durante muchos años y sus aplicaciones en la industria animal tal como en la industria de cría de animales han aumentado rápidamente. Un citómetro de flujo disponible comercialmente utiliza normalmente una geometría cilíndrica de fluido en su boquilla. Este tipo de sistema de citómetro de flujo tiene un recorrido de flujo que se centra con una simetría de revolución, como se describe en algunas patentes de los EE.UU. (n.os de patente: 5.602.039, 5.483.469, 4.660.971, 4.988.619 y 5.466.572) . Este tipo de diseño, según la ley de similitud, no produce muestras orientadas de forma radial. En los campos clínico, de cría de animales y de investigación biológica, cuando se clasifican células tales como espermatozoides, pueden ser pre-teñidas con una tinción que produce fluorescencia cuando se expone a una fuente de luz de excitación. Como se explicó en la patente de los EE.UU. n.° 5.135.759 de Lawrence Johnson, se puede utilizar un citómetro de flujo que detecta la fluorescencia emitida perpendicular al eje de flujo con gran precisión en la medición y en la discriminación del contenido de ADN de las células. Sin embargo, como otros han señalado, incluso esta precisión en la medición del

contenido de ADN solo puede conseguirse de forma más eficaz cuando las células de interés son esféricas o cilíndricas (Dean y cols., 1978, Biophys. J. 23: 1-5) . En cuanto a los espermatozoides -que tienen cabezas planas-la intensidad observada de fluorescencia depende en gran parte de la orientación apropiada de las cabezas con respecto al detector. Los espermatozoides emiten una señal fluorescente más fuerte desde el borde de la superficie plana. Por lo tanto, la intensidad de la señal fluorescente depende de la orientación de la cabeza del espermatozoide según pasa por el detector. Debido a que el contenido de ADN se determina por medio de fluorescencia y debido a que la intensidad fluorescente se ve afectada por la orientación, la determinación del contenido de ADN puede complicarse por la falta de orientación en una boquilla. Por esta razón, sin una orientación radial, la distribución de intensidad de fluorescencia resultante obtenida para cabezas normales de espermatozoide orientadas al azar refleja tanto el contenido de ADN como la orientación de las cabezas. Debido a que las células emiten una señal de fluorescencia más brillante desde el borde de la cabeza (Gledhill y cols., 1976, J. Cell Physiol. 87: 367-376; Pinkel y cols., 1982, Cytometr y 7: 268-273) la precisión de la determinación del contenido de ADN (que puede diferir en tan solo el 3, 5 %) se ve muy afectada por la orientación de las células. Por esta razón, el citómetro convencional de flujo ha sufrido limitaciones, especialmente cuando se clasifican espermatozoides aplanados u otras células no esféricas o no cilíndricas y similares.

Además, ciertas células pueden exhibir una funcionalidad reducida como resultado del procedimiento de clasificación. Esto puede ser particularmente cierto para células tales como espermatozoides de mamíferos que no son solo delicados mecánicamente, sino que también se vuelven funcionalmente incapacitados (como quizás se puede ver por de una fertilidad reducida) o incluso heridos mortalmente como resultado de alguna incidencia en el procedimiento de 45 clasificación. Ha habido limitaciones significativas en las tentativas de citometría de flujo con células delicadas acerca de las capacidades. Esto es más grave en el campo altamente especializado de clasificación de espermatozoides no solo porque las propias células son excepcionalmente delicadas, sino también porque existe la necesidad de tasas extremadamente elevadas de clasificación por razones fisiológicas y prácticas. Ha sucedido que estas dos necesidades contrapuestas suponen retos sumamente críticos en el campo excepcional de clasificación de esperma con fines comerciales de cría. Por lo tanto, aunque estos dos aspectos -una manipulación y una orientación con cuidado-son quizás aplicables de forma independiente en una variedad de casos, en muchos casos pueden actuar de forma sinérgica. Tanto sus caracteres como sus interrelaciones sinérgicas son quizás más críticas en el campo comercial de clasificación de esperma. De modo interesante, parece que esta sinergia e interrelación potencial no han sido apreciadas completamente antes de la presente invención.

Vistos por separado, el aspecto de una orientación apropiada de una muestra que contiene partículas o células puede ser vista por lo tanto que desempeña un papel importante en la intensidad y en la calidad de la señal del citómetro de flujo y en la eficacia de clasificación. Se han realizado esfuerzos para orientar la muestra de forma hidrodinámica y se ha explorado en las últimas décadas el uso de la orientación hidrodinámica de la muestra en flujo a través de sistemas y citómetros de flujo (Fulwyler, 1977, J. Histochem. Cytochem. 25: 781-783; Kachel y cols., 1977, J. Histochem. Cytochem. 25: 774-780; Dean y cols., supra) . La orientación hidrodinámica de la muestra dentro del citómetro de flujo puede mejorar la medición precisa del contenido relativo de tinción del ADN y también puede proporcionar una medición potencialmente útil de parámetros morfológicos tales como grosor de las células y grado de curvatura de la cara plana. Para algunas aplicaciones, esta orientación es sencilla. No obstante, cuando hay implicadas células 65 delicadas (tal como espermatozoides) u otras partículas, ha sido necesaria, sin embargo, una técnica más cuidadosa. Por ejemplo, incluso se ha utilizado un tubo de inyección de muestras con una punta con forma de cuña en algunos intentos por aumentar el porcentaje de las células orientadas (Dean y cols., 1978, Biophys. J. 23: 1-5; Fulwyler, 1977,

J. Histochem. Cytochem. 25: 781-783; Johnson y cols., 1986, Cytometr y 7: 268-273; Pinkel y cols., 1982, Cytometr y 3: 1-9; Welch y cols., 1994, Cytometr y 17 (supl. 7) : 74) . Debido a esta punta con forma de cuña del tubo de inyección de muestras, la corriente de muestras tendía a ser aspirada en una banda delgada por el fluido envolvente a diferencia de lo que ocurre en una corriente cilíndrica. Las células con cabezas planas tal como espermatozoides de mamíferos, encontraron a menudo el fluido envolvente a una mayor velocidad (100 mm/seg) y fueron giradas de forma que sus lados planos se encontraban en el plano de la banda. Por desgracia, la separación del evento de orientación y el evento de análisis final pueden provocar resultados que no llegan a ser óptimos. Por lo tanto, esta técnica no ha mostrado ser prácticamente tan ventajosa como se desea.

En una aplicación distinta, Kachel y sus colegas (Kachel y cols., supra) demostraron la ley de similitud y expusieron tres tipos de recorridos de flujo que influyen en las partículas en movimiento. Concluyeron que, para conseguir una orientación radial uniforme con fuerzas hidrodinámicas para partículas planas tales como hematíes aplanados, el recorrido preferido de flujo sería aquel en mediante que se obtuviese una constricción unilateral. El recorrido de flujo más sencillo que exhibe una constricción unilateral incrementada en uso con un sistema de flujo a través del mismo se haría de un tubo con un corte transversal elipsoidal y también terminaría en una salida elipsoidal. En una disposición, el eje largo de esta salida elipsoidal estaría ubicado en un ángulo recto con el eje largo en el corte transversal del tubo elíptico de constricción. Sin embargo, dado que la salida elíptica no produce el tipo de gotitas deseado para un citómetro de flujo de alta velocidad clasificador de células, no está previsto que esta disposición se utilice en un citómetro de flujo y aparentemente no se ha aplicado a uno.

En un intento similar, Rens y sus colegas diseñaron una punta de boquilla que tenía un interior elíptico y un orificio elíptico de salida (Rens y cols., 1998, Publicación PCT n.°: PCT/US98/15403; Rens y cols., 1998, Cytometr y 33: 476-481; Rens y cols., 1999, Mol. Reprod. Dev. 52: 50-56) . Este interior contenía una primera zona elipsoidal y una segunda zona elipsoidal que estaban separadas por una zona... [Seguir leyendo]

1. Un sistema de citómetro de flujo, que comprende:

a. un tubo de inyección de muestras (3) que tiene un punto de inyección a través del que se puede introducir una muestra,

b. un recipiente de fluido envolvente (1) que tiene un extremo inferior y en el que dicho tubo de inyección de muestras

(3) está localizado dentro de dicho recipiente de fluido envolvente (1) ,

c. una vía de acceso de fluido envolvente conectada a dicho recipiente de fluido envolvente (1) ,

d. una boquilla de una sola orientación torsional (6) localizada al menos en parte debajo de dicho punto de inyección, y

e. un sistema analítico que detecta por debajo de dicha boquilla de una sola orientación torsional (6) ;

en el que dicha boquilla de una sola orientación torsional (6) comprende un elemento de una sola superficie interior torsional que tiene un elemento de una sola superficie interior torsional, elipsoidal ahusado, que está dividido en una zona interior elíptica ahusada (c) y una zona interior cilíndrica (d) y en el que la zona interior elíptica ahusada (c) está conectada directamente a la zona interior cilíndrica (d) y un orificio circular de salida (15) de la boquilla (6) .

2. Un sistema de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 1 y que comprende adicionalmente un sistema de recogida de esperma.

3. Un sistema de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 1, en el que dicho elemento de una sola superficie interior torsional, elipsoidal ahusado, comprende:

a. una ubicación de demarcación en forma de elipse (9) localizada en aproximadamente dicho punto de inyección, y

b. una zona de elipticidad decreciente (10) que se extiende desde debajo de dicha ubicación de demarcación en forma de elipse (9) .

4. Un sistema de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 1, en el que dicha zona interior ahusada (c) ,

en forma de elipse, comprende: 35

a. una zona de elipticidad creciente (8) ;

b. una ubicación de demarcación en forma de elipse (9) corriente abajo a partir de dicha zona de elipticidad creciente (8) ; y

c. una zona de elipticidad decreciente (10) que se extiende desde dicha ubicación de demarcación en forma de elipse (9) .

5. Un sistema de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 3 o 4 y que comprende adicionalmente: 45

a. una zona cónica (12) localizada debajo de dicha zona de elipticidad decreciente (10) ; y en el que

b. dicha zona cilíndrica (14) localizada debajo de dicha zona cónica (12) ; en la que tanto dicha zona cónica (12) como dicha zona cilíndrica (14) comprenden un superficie de flujo laminar;

c. el orificio circular de salida (15) localizado debajo de dicha zona cilíndrica (14) ;

d. un oscilador para el que dicho orificio circular de salida (15) tiene capacidad de respuesta; y 55 e. un sistema de clasificación de citometría de flujo por debajo de dicha boquilla de una sola orientación torsional (6) .

6. Un sistema de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 5, en el que dicho elemento de una sola superficie interior torsional, elipsoidal ahusado, dicha zona cónica (12) y dicha zona cilíndrica (14) son unitarias.

7. Un sistema de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 6, en el que dicha boquilla de una sola orientación torsional (6) tiene una dirección corriente abajo, en el que dicha zona de elipticidad decreciente (10) tiene cortes transversales y áreas de corte transversal, en los que dichos cortes transversales de dicha zona de elipticidad decreciente (10) sufren cambios de transición de formas similares a elipse a formas circulares corriente abajo y en los que dichas áreas de corte transversal llegan a ser progresivamente más pequeñas corriente abajo.

8. Un sistema de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 7, en el que cada una de dichas secciones

transversales de dicha zona de decrecimiento elipsoidal (10) tiene un eje mayor y un eje menor y en el que dicho eje mayor y dicho eje menor llegan a ser progresivamente iguales corriente abajo.

9. Un sistema de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 5, en el que dicho elemento de una sola

superficie interior torsional, elipsoidal ahusado, comprende un elemento de superficie interior que se ahúsa a aproximadamente 23º.

10. Un sistema de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 6, en el que dicho elemento de una sola superficie interior torsional, elipsoidal ahusado, tiene una boca (11) y en el que dicha boca (11) es de aproximadamente 25 mm de diámetro y dicho orificio circular de salida (15) es de aproximadamente 0, 07 mm de diámetro.

11. Un sistema de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 4, en el que dicho tubo de inyección de muestras que mejora la orientación comprende una punta biselada (4) . 15

12. Un sistema de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 11, en el que dicha punta biselada tiene una boca circular (5) y en el que dicha boca circular (5) tiene un diámetro de aproximadamente 0, 01 mm.

13. Un sistema de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 11, en el que dicha zona interior elipsoidal

tiene un eje mayor y un eje menor en dicho punto de inyección y en la que dicho eje mayor de dicha punta biselada (4) está alineado con dicho eje mayor de dicha zona interior elipsoidal ahusada en dicho punto de inyección.

14. Un sistema de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 13, en el que dicho punto de inyección está

localizado aproximadamente a 6 mm desde dicho orificio circular de salida (15) de dicha boquilla de una sola 25 orientación torsional (6) .

15. Un sistema de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 1, en el que dicha muestra comprende espermatozoides en un tampón compatible con esperma.

16. Un sistema de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 15, en el que dicho sistema analítico comprende un sistema de clasificación por citometría de flujo.

17. Un sistema de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 15 y que además comprende un sistema de recogida compatible con esperma.