Un procedimiento para producir de manera práctica un mamífero equino,

que comprende las etapas de: a. determinar un tiempo estimado de estro de un mamífero equino hembra, teniendo dicha hembra dos cuernos uterinos, teniendo cada cuerno uterino una punta y un folículo; b. recoger células espermáticas equinas de un mamífero equino macho; c. orientar dichas células espermáticas recogidas dentro de un citómetro de flujo para detectar señales fluorescente emitidas desde dichas células espermáticas dentro de dicho citómetro de flujo; d. seleccionar electrónicamente dichas señales fluorescentes emitidas desde dichas células espermáticas dentro de dicho citómetro de flujo; e. determinar la característica de sexo de una pluralidad de dichas células espermáticas equinas dentro de dicho citómetro de flujo; f. clasificar dichas células espermáticas equinas a una tasa de más de 900 clasificaciones por segundo usando dicho citómetro de flujo de acuerdo con la determinación de su característica de sexo; g. seleccionar específicamente un fluido envolvente, de modo que pueda servir de una manera coordinada tanto con el entorno fluido de células pre-clasificadas como con el entorno fluido de células post-clasificadas para dichas células en dicho citómetro de flujo; h. establecer una muestra de inseminación equina que contenga al menos alguna de dichas células espermáticas equinas clasificadas de dicho mamífero equino macho; i. insertar no quirúrgicamente al menos una parte de dicha muestra de inseminación equina en dicho mamífero equino hembra; j. inseminar artificialmente dicho mamífero equino hembra; k. fertilizar al menos un óvulo equino dentro de dicho mamífero equino hembra; y I. producir un mamífero descendiente equino del sexo deseado

I. CAMPO TÉCNICO

Esta invención se refiere generalmente al campo de la inseminación artificial de equinos. También implica la inseminación artificial equina si ha habido una selección sexual de los espermatozoides para producir un descendiente equino del sexo deseado. Es especialmente relevante en las situaciones en las que se desea una inseminación artificial 5 equina no quirúrgica y también en las que es de importancia práctica la inseminación artificial equina con dosis baja.

II. ANTECEDENTES

La inseminación artificial de yeguas equinas ha sido de importancia durante muchos años. A menudo ésta se ha llevado a cabo de manera quirúrgica. En los ejemplos rutinarios en los que no se requieren dosis de espermatozoides menores, se ha llevado a cabo sin cirugía mediante inseminación artificial, sin embargo, ésta usa una cantidad 10 relativamente elevada de espermatozoides. Para la inseminación artificial rutinaria de la yegua, normalmente se recomienda inseminar con 250-500 x 106 espermatozoides progresivamente móviles (epm) cada dos días a una yegua en estro, para obtener una fertilidad máxima. Desafortunadamente, al inseminar las yeguas con semen de un semental altamente fértil, la fertilidad disminuye al reducirse la cantidad de espermatozoides móviles. Bajo condiciones ideales, se ha inseminado exitosamente una yegua con tan solo 100 x 106 epm sin reducir la fertilidad, sin embargo, incluso esta 15 cantidad plantea retos. Es necesaria la inseminación con una cantidad baja de espermatozoides si se usa semen sexado clasificado y semen congelado-descongelado en una cantidad limitada.

Por supuesto, es de interés la preselección del sexo de la descendencia en un animal equino. La preselección del sexo tras la inseminación artificial (IA) con una cantidad baja de poblaciones enriquecidas, separadas de espermatozoides que portan el cromosoma X y que portan el Y que se han separado basándose en el contenido de ADN 20 es actualmente posible en otras especies, sin embargo, se ha probado que en cierta manera es más difícil en las especies equinas. Mientras que el nacimiento de la progenie del sexo deseado tras la inseminación intrauterina de reses y ovejas ha ratificado la tecnología de sexado, hasta la presente invención, no se ha aplicado de manera práctica a equinos.

Lograr la preselección de sexo implica separar los espermatozoides que portan el cromosoma X de los que portan el Y seguido del uso de inseminación artificial (IA) o de fertilización in vitro (FIV) y posteriormente la transferencia 25 del embrión. La citometría de flujo de alta velocidad actual permite a los investigadores clasificar > 1000 espermatozoides sexados vivos/segundo. Sin embargo, la clasificación sola no es suficiente. Para conseguir que el sexado del semen sea una técnica práctica para un programa de IA equina comercial, se requiere una cantidad inferior de espermatozoides móviles para una dosis de inseminación. Al usar semen reciente para la IA en una yegua, una dosis típica podría contener entre 250 - 500 x 106 espermatozoides móviles. Con la tasa de clasificación actual de -1000 espermatozoides 30 vivos/segundo, llevaría casi seis días clasificar una dosis de inseminación Por consiguiente, para lograr de manera práctica una fertilidad razonable se requiere una cantidad inferior de espermatozoides móviles. Una vez se logra esto, también se considera como necesaria de manera práctica la fertilidad potenciada con inseminación no quirúrgica de yeguas con semen sexado.

Tal como se ha mencionado, la preselección del sexo implica el uso de contenido de ADN y la separación de 35 espermatozoides en poblaciones que portan el cromosoma X de las que portan el Y. El uso de citometría de flujo de alta velocidad actual permite a los investigadores clasificar hasta 1000 espermatozoides vivos/segundo del sexo deseado con una precisión del 90%, lo que proporciona una cantidad adecuada de espermatozoides en muchas especies distintas a la equina en una cantidad de tiempo razonable. Por ejemplo, esta tecnología nueva para el sexado de los espermatozoides se ha convertido en una técnica práctica para la inseminación artificial en reses. Ya que es práctico clasificar sólo una 40 cantidad baja de espermatozoides y mantener todavía la viabilidad del esperma, un aspecto de la invención trata la potenciación de las tasas de gestación tras la inseminación de 25 x 106 espermatozoides progresivamente móviles (epm), no clasificados. Esto es aproximadamente un décimo de lo que previamente se consideraba óptimo para operaciones rutinarias. Otros aspectos tratan de cantidades incluso menores. Estos aspectos pueden tener consecuencias económicas significativas si se considera su aplicación para animales de trofeo célebres tales como caballos y similares. 45

Tal como se ha mencionado, uno de los retos fundamentales al que se enfrenta el esfuerzo de clasificar los espermatozoides equinos X y los Y es la gran cantidad de espermatozoides implicados. En la inseminación natural se producen casi un billón de espermatozoides equinos; en la inseminación artificial menos, pero normalmente todavía se usa una gran cantidad significativa de espermatozoides equinos. Por ejemplo, las técnicas de inseminación artificial equina usan de manera rutinaria de doscientos cincuenta millones a quinientos millones de espermatozoides. Por tanto, 50 se supone que es necesaria una cantidad significativa de espermatozoides en un entorno de inseminación artificial equina.

En tanto que la invención se refiere a la inseminación artificial con selección de sexo, se han intentado muchos procedimientos para lograr la separación de espermatozoides que portan el cromosoma X de los que portan el Y en otros animales. Sin embargo, ninguno de estos han abordado aspectos propios de o la clasificación específica de las células 55 espermáticas equinas. Los procedimientos de clasificación generales varían desde las técnicas magnéticas tales como las que aparecen descritas en la patente de los EE.UU. número 5514537 hasta las técnicas gravimétricas tal como se discute en las patentes de los EE.UU. número 3894529, patente reexpedida número 32350, patentes de los EE.UU.

número 4092229, 4067965 y 4155831. Las propiedades eléctricas también se han intentado determinar tal como se muestra en el documento de los EE.UU. 4083957, así como una combinación de las propiedades eléctricas y gravimétricas tal como se discute en las patentes de los EE.UU. número 4225405, 4698142 y 4749458. Los esfuerzos en la movilidad también se han intentado determinar tal como se muestra en las patentes de los EE.UU. número 4009260 y 4339434. Las técnicas químicas tales como las mostradas en las patentes de los EE.UU. número 4511661 y 4999283 5 (que implican anticuerpos monoclonales) y las patentes de los EE.UU. número 5021244, 5346990, 5439362 y 5660997 (que implican proteínas de membrana) y las patentes de los EE.UU. número 3687803, 4191749, 4448767 y 4680258 (que implican anticuerpos) así como la adición de componentes de suero tal como se muestra en la patente de los EE.UU. número 4085205. Aunque cada una de estas técnicas se ha presentado como altamente eficaz, de hecho en la actualidad ninguna de estas técnicas proporciona el nivel de preselección de sexo deseado y ninguna ha mostrado éxito en el nivel 10 de inseminación artificial con espermatozoides equinos. Sin embargo, independientemente de la técnica de separación usada finalmente, las combinaciones competidoras de la elevada cantidad de espermatozoides equinos presentes de manera natural y la aproximación de separar los espermatozoides que portan el cromosoma X de los que portan el Y hacen que sea deseable desarrollar una capacidad de lograr la inseminación equina con una cantidad menor de espermatozoides. 15

La técnica cuantitativa usada para lograr la separación de los espermatozoides que portan el cromosoma X de los que portan el Y para la inseminación artificial (de cualquier especie) es la que implica la técnica de citometría de flujo. Esta técnica parecía posible como resultado de avances y descubrimientos que implican la absorción diferencial de colorante de espermatozoides que portan el cromosoma X y de los que portan el Y. Esto se debatió anteriormente en la patente de los EE.UU. número 4362246 y se expandió de manera significativa por medio de las técnicas descritas por 20 Lawrence Johnson en la patente de los EE.UU. número 5135759. La técnica de Johnson de utilizar citometría de flujo para separar los espermatozoides que portan el cromosoma X de los que portan el Y ha sido un avance tan significativo que ha conseguido por primera vez la separación comercial... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir de manera práctica un mamífero equino, que comprende las etapas de:

a. determinar un tiempo estimado de estro de un mamífero equino hembra, teniendo dicha hembra dos cuernos uterinos, teniendo cada cuerno uterino una punta y un folículo;

b. recoger células espermáticas equinas de un mamífero equino macho; 5

c. orientar dichas células espermáticas recogidas dentro de un citómetro de flujo para detectar señales fluorescente emitidas desde dichas células espermáticas dentro de dicho citómetro de flujo;

d. seleccionar electrónicamente dichas señales fluorescentes emitidas desde dichas células espermáticas dentro de dicho citómetro de flujo;

e. determinar la característica de sexo de una pluralidad de dichas células espermáticas equinas dentro de dicho 10 citómetro de flujo;

f. clasificar dichas células espermáticas equinas a una tasa de más de 900 clasificaciones por segundo usando dicho citómetro de flujo de acuerdo con la determinación de su característica de sexo;

g. seleccionar específicamente un fluido envolvente, de modo que pueda servir de una manera coordinada tanto con el entorno fluido de células pre-clasificadas como con el entorno fluido de células post-clasificadas para 15 dichas células en dicho citómetro de flujo;

h. establecer una muestra de inseminación equina que contenga al menos alguna de dichas células espermáticas equinas clasificadas de dicho mamífero equino macho;

i. insertar no quirúrgicamente al menos una parte de dicha muestra de inseminación equina en dicho mamífero equino hembra; 20

j. inseminar artificialmente dicho mamífero equino hembra;

k. fertilizar al menos un óvulo equino dentro de dicho mamífero equino hembra; y

I. producir un mamífero descendiente equino del sexo deseado.

2. Un procedimiento para producir de manera práctica un mamífero equino tal como se describe en la reivindicación 1, en el que dichas etapas de determinar la característica de sexo de una pluralidad de dichas células espermáticas 25 equinas y de clasificar dichas células espermáticas equinas de acuerdo con la determinación de su característica de sexo comprenden además las etapas de:

a. teñir dichas células espermáticas equinas;

b. concentrar dichas células espermáticas equinas clasificadas;

3. Un procedimiento para producir de manera práctica un mamífero equino tal como se describe en la reivindicación 2, 30 en el que dicha etapa de clasificar de acuerdo con dicho sexo de dichas células espermáticas equinas comprende la etapa de hacer funcionar un clasificador de células de alta velocidad a una presión de al menos aproximadamente 344.737 Pa (cincuenta libras por pulgada cuadrada).

4. Un procedimiento para producir de manera práctica un mamífero equino tal como se describe en la reivindicación 2, en el que dicha etapa de clasificar de acuerdo con dicho sexo de dichas células espermáticas equinas comprende la 35 etapa de recoger células espermáticas equinas que tienen la característica de sexo deseada en una solución de leche desnatada.

5. Un procedimiento para producir de manera práctica un mamífero equino tal como se describe en la reivindicación 1, en el que dicha etapa de establecer una muestra de inseminación equina que contenga al menos alguna de dichas células espermáticas equinas de dicho mamífero equino macho comprende la etapa de establecer una muestra de 40 inseminación equina que contenga al menos alguna de dichas células espermáticas equinas dicho mamífero equino y que tenga un número bajo de dichas células espermáticas equinas con relación a la dosificación de inseminación artificial típica seleccionada del grupo que consta de: una muestra de inseminación equina de no más de aproximadamente cinco millones de células espermáticas y una muestra de inseminación equina de no más de aproximadamente veinticinco millones de células espermáticas. 45

6. Un procedimiento para producir de manera práctica un mamífero equino tal como se describe en la reivindicación 5, en el que dicha etapa de establecer una muestra de inseminación equina que contenga al menos alguna de dichas células espermáticas equinas dicho mamífero equino macho comprende la etapa de establecer una muestra de inseminación equina que tenga un volumen seleccionado del grupo: 0,2 ml ó 1 ml.

7. Un procedimiento para producir de manera práctica un mamífero equino tal como se describe en la reivindicación 1, en 5 el que dicha etapa de insertar no quirúrgicamente al menos una parte de dicha muestra de inseminación equina en dicho mamífero equino hembra comprende la etapa de insertar al menos una parte de dicha muestra de inseminación equina de manera profunda dentro de al menos uno de dichos cuernos uterinos de dicha hembra cerca de la punta de dicho cuerno uterino.

8. Un procedimiento para producir de manera práctica un mamífero equino tal como se describe en la reivindicación 2, en 10 el que dicha etapa de insertar no quirúrgicamente al menos una parte de dicha muestra de inseminación equina en dicho mamífero equino hembra comprende la etapa de insertar al menos una parte de dicha muestra de inseminación equina de manera profunda dentro de al menos uno de dichos cuernos uterinos de dicha hembra cerca de la punta de dicho cuerno uterino.

9. Un procedimiento para producir de manera práctica un mamífero equino tal como se describe en la reivindicación 7, en 15 el que dicha etapa de inseminar artificialmente dicho mamífero equino hembra comprende la etapa de inseminar artificialmente dicho equino hembra en una única ocasión próxima a la ovulación.

10. Un procedimiento para producir de manera práctica un mamífero equino tal como se describe en la reivindicación 8, en el que dicha etapa de inseminar artificialmente dicho mamífero equino hembra comprende la etapa de inseminar artificialmente dicho equino hembra en una única ocasión próxima a la ovulación. 20

11. Un procedimiento para producir de manera práctica un mamífero equino tal como se describe en la reivindicación 9, y que comprende adicionalmente la etapa de manipular la ovulación de dicho mamífero equino hembra antes de llevar a cabo la etapa de inseminar artificialmente dicho mamífero equino hembra.

12. Un procedimiento para producir de manera práctica un mamífero equino tal como se describe en la reivindicación 10, y que comprende adicionalmente la etapa de manipular la ovulación de dicho mamífero equino hembra antes de llevar 25 a cabo la etapa de inseminar artificialmente dicho mamífero equino hembra.

13. Un procedimiento para producir de manera práctica un mamífero equino tal como se describe en la reivindicación 11, en el que dicha etapa de manipular la ovulación de dicho mamífero equino hembra antes de llevar a cabo la etapa de inseminar artificialmente dicho mamífero equino hembra comprende la etapa de administrar una hormona de liberación de gonadotropina a dicho mamífero equino hembra. 30

14. Un procedimiento para producir de manera práctica un mamífero equino tal como se describe en la reivindicación 12, en el que dicha etapa de manipular la ovulación de dicho mamífero equino hembra antes de llevar a cabo la etapa de inseminar artificialmente dicho mamífero equino hembra comprende la etapa de administrar una hormona de liberación de gonadotropina a dicho mamífero equino hembra.

15. Un procedimiento para producir de manera práctica un mamífero equino tal como se describe en la reivindicación 13, 35 en el que dicha etapa de inseminar artificialmente dicho mamífero equino hembra se lleva a cabo en un tiempo seleccionado del grupo que consta de: aproximadamente treinta y cuatro horas después de dicha etapa de administrar dicha hormona de liberación de gonadotropina a dicho mamífero equino hembra, aproximadamente cuarenta horas después de dicha etapa de administrar dicha hormona de liberación de gonadotropina a dicho mamífero equino hembra y entre aproximadamente treinta y cuatro horas y aproximadamente cuarenta horas después de dicha etapa 40 de administrar dicha hormona de liberación de gonadotropina a dicho mamífero equino hembra.

16. Un procedimiento para producir de manera práctica un mamífero equino tal como se describe en la reivindicación 14, en el que dicha etapa de inseminar artificialmente dicho mamífero equino hembra se lleva a cabo en un tiempo seleccionado del grupo que consta de: aproximadamente treinta y cuatro horas después de dicha etapa de administrar dicha hormona de liberación de gonadotropina a dicho mamífero equino hembra, aproximadamente cuarenta horas 45 después de dicha etapa de administrar dicha hormona de liberación de gonadotropina a dicho mamífero equino hembra y entre aproximadamente treinta y cuatro horas y aproximadamente cuarenta horas después de dicha etapa de administrar dicha hormona de liberación de gonadotropina a dicho mamífero equino hembra.

17. Un procedimiento para producir de manera práctica un mamífero equino tal como se describe en la reivindicación 13, en el que dicha etapa de insertar al menos una parte de dicha muestra de inseminación equina de manera profunda 50 dentro de al menos uno de dichos cuernos uterinos de dicha hembra cerca de la punta de dicho cuerno uterino comprende las etapas de:

a. establecer una sonda flexible que tenga un recipiente de espermatozoides;

b. colocar dicha sonda flexible en la vagina de dicho mamífero equino hembra;

c. manipular dicha sonda flexible en dicho útero de dicho mamífero equino hembra;

d. guiar dicha sonda flexible dentro de un cuerno uterino de dicho mamífero equino hembra; y

e. manipular suavemente dicha sonda flexible por vía rectal mientras se guía de manera profunda dentro de dicho cuerno uterino de dicho mamífero equino hembra hasta una localización profunda dentro de dicho cuerno uterino 5 de dicha hembra cerca de la punta de dicho cuerno uterino.

18. Un procedimiento para producir de manera práctica un mamífero equino tal como se describe en la reivindicación 14, en el que dicha etapa de insertar al menos una parte de dicha muestra de inseminación equina de manera profunda dentro de al menos uno de dichos cuernos uterinos de dicha hembra cerca de la punta de dicho cuerno uterino comprende las etapas de: 10

a. establecer una sonda flexible que tenga un recipiente de espermatozoides;

b. colocar dicha sonda flexible en la vagina de dicho mamífero equino hembra;

c. manipular dicha sonda flexible en dicho útero de dicho mamífero equino hembra;

d. guiar dicha sonda flexible dentro de un cuerno uterino de dicho mamífero equino hembra; y

e. manipular suavemente dicha sonda flexible por vía rectal mientras se guía de manera profunda dentro de dicho 15 cuerno uterino de dicho mamífero equino hembra hasta una localización profunda dentro de dicho cuerno uterino de dicha hembra cerca de la punta de dicho cuerno uterino.