Bacteria pasteurelácea atenuada que tiene una mutación en un gen de virulencia.

Una bacteria atenuada de Pasteurella multocida, que comprende una mutación en un gen representado por una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido fhaC

(i) en la que la secuencia polinucleotídica hibrida con el complemento de la SEC ID N.

O: 19 en condiciones restrictivas, comprendiendo tales condiciones un lavado final en tampón que comprende SSC 2X/SDS al 0,1 %, a 35°C hasta 45°C, o

(ii) en la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos idéntica en un 80 % a la SEC ID NO: 20,

en la que la atenuación de la bacteria está causada por dicha mutación.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10181686.

Solicitante: Zoetis P&U LLC.

Inventor/es: LOWERY, DAVID E., KENNEDY, MICHAEL, J., FULLER,Troy,E.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K35/74 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 35/00 Preparaciones medicinales que contienen sustancias de constitución indeterminada o sus productos de reacción. › Bacterias (uso terapéutico de una proteína de la bacteria A61K 38/00).
  • A61K39/02 A61K […] › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Antígenos bacterianos.
  • A61K39/102 A61K 39/00 […] › Pasteurella; Haemophilus.
  • A61K39/395 A61K 39/00 […] › Anticuerpos (aglutininas A61K 38/36 ); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario.
  • A61P31/04 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES.A61P 31/00 Antiinfecciosos, es decir antibióticos, antisépticos, quimioterápicos. › Agentes antibacterianos.
  • C07K14/285 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Pasteurellaceae (F), p. ej. Haemophilus influenza.
  • C07K16/12 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra materiales bacterianos.
  • C12N1/15 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N1/19 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N1/21 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/01 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Preparación de mutantes sin introducción de material genético extraño; Procedimientos de cribado para ello.
  • C12N15/09 C12N 15/00 […] › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12N15/31 C12N 15/00 […] › Genes que codifican proteínas microbianas, p. ej. enterotoxinas.
  • C12N15/63 C12N 15/00 […] › Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión.
  • C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
  • C12P21/02 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.
  • C12P21/08 C12P 21/00 […] › Anticuerpos monoclonales.
  • C12Q1/18 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › Investigación o análisis de la actividad antimicrobiana de un material.
  • G01N33/15 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › preparaciones medicinales.
  • G01N33/50 G01N 33/00 […] › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
  • G01N33/53 G01N 33/00 […] › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
  • G01N33/569 G01N 33/00 […] › para microorganismos, p. ej. protozoarios, bacterias, virus.
  • G01N33/577 G01N 33/00 […] › en los que interviene anticuerpos monoclonados.

PDF original: ES-2535961_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Bacteria pasteurelácea atenuada que tiene una mutación en un gen de virulencia Campo de la invención

La presente invención se refiere de forma general a la identificación de genes responsables de la virulencia de las bacterias Pasteurella multocida y Actinobacillus pleuropneumoniae, permitiendo por lo tanto la producción de nuevas cepas mutantes atenuadas útiles en vacunas y la identificación de agentes antibacterianos nuevos que tiene como objetivo los genes de virulencia y sus productos.

Antecedentes de la invención

La familia de las pasteureláceas abarca varios patógenos significativos que infectan una amplia diversidad de animales. Además de P. multocida, miembros destacados de la familia incluyen Pasteurella haemolytica, Actinobacillus pleuropneumoniae y Haemophilus somnus. P. multocida es un cocobacilo gram-negativo, carente de motilidad que se encuentra en la flora normal de muchos animales salvajes y domésticos y se sabe que es la causa de enfermedad en numerosas especies animales en todo el mundo [Biberstein, In M. Kilian, W. Frederickson y E. L. Biberstein (ed.), Haemophilus, Pasteurella und Actinobacillus. Academic Press. Londres, páginas 61-73 (1981)]. Las manifestaciones morbosas tras la infección incluyen septicemias, bronconeumonfas, rinitis e infecciones de heridas [revisado en Shewen y cois., In C. L. Gyles y C. O. Thoen (ed.), Pathogenesis of Bacterial Infections in Animáis, lowa State University Press, Ames, p. 216-225 (1993), incorporado a la presente memoria por referencia].

La infección por P. multocida resulta generalmente de la invasión durante periodos de estrés, pero la transmisión puede ocurrirtambién por aerosol o por exposición por contacto, o por medio de pulgas y garrapatas vectores. En aves de corral, la infección por P. multocida da lugar a septicemia de aguda a peraguda, particularmente prevalente en pavos domésticos y aves acuáticas salvajes en condiciones de estrés asociadas con hacinamiento, puesta, muda, o cambio climático grave. En ganado, una septicemia hemorrágica similar sigue a la infección y manifiesta afecciones que incluyen fiebre alta y depresión, seguidas generalmente por muerte rápida. La transmisión es contacto con aerosol más probable, pero la infección puede surgir durante periodos de cambio climático significativo. En conejos, la infección da lugar a rinitis purulenta recurrente, generalmente seguida por conjuntivitis, otitis media, sinusitis, abcesos subcutáneos y bronconeumonía crónica. En infecciones graves, la mortalidad de conejos surge de bronconeumonía fibrinosa aguda, septicemia, o endotoxemia. Los estados morbosos normalmente surgen durante periodos de estrés. En cerdos, los estados morbosos de P. multocida comunes incluyen rinitis atópica y neumonía bacteriana. Afecciones pulmonares similares también se detectan en perros, gatos, cabras y ovejas. P. multocida se detecta comúnmente en la flora oral de muchos animales y es por lo tanto un contaminante común en heridas de mordiscos y de arañazos.

Las cepas de P. multocida se designan normalmente por los serogrupos capsular y somático. Se distinguen cinco serogrupos capsulares (A, B, D, E y F) y 16 serotipos somáticos por expresión de antígenos térmicamente estables característicos. La mayoría de las cepas son específicas de huésped y raramente infectan más de uno o dos animales. La existencia de serotipos diferentes presenta un problema para vacunación debido a que las células bacterianas completas muertas proporcionan normalmente solo protección específica de serotipo. Sin embargo, se ha demostrado que la infección natural con un serotipo puede conducirá protección inmunológica contra serotipos múltiples [Shewen y cois., In C. L. Gyles y C. O. Thoen (Ed ), Pathogenesis of Bacterial Infections in Animáis, lowa State University Press, Ames, p. 216-225 (1993)] y se puede estimular protección cruzada usando bacterias inactivadas in vivo [Rimlery cois., Am J Vet Res. 42: 2117-2121 (1981)]. Una cepa de P. multocida mutante espontánea se ha utilizado como una vacuna y se ha mostrado que estimula una respuesta inmune fuerte [Davis, Poultry Digest. 20: 430-434 (1987), Schlinky cois., Avian Dis. 31 (1): 13-21 (1987)]. Esta cepa atenuada, sin embargo, ha mostrado revertirá un estado virulento o causar mortalidad si el receptor de la vacuna está estresado [Davis, Poultry Digest. 20: 430-434 (1987), Schlinky cois., Avian Dis. 31 (1): 13-21 (1987)];

Otro miembro de la familia de las pasteureláceas, A. pleuropneumoniae muestra especificidad de huésped estricta para cerdos y es el agente causante de pleuroneumonía porcina altamente contagiosa. La infección surge normalmente en condiciones de cría intensiva y se cree que ocurre por un modo directo de transmisión. La infección es a menudo fatal y como resultado conduce a pérdida económica grave en la industria de producción porcina. Una infección de pleuroneumonía puede ser aguda o crónica y la infección se caracteriza por una bronconeumonía hemorrágica, necrótica con pleuritis fibrinosa acompañante. Hasta la fecha, la virulencia bacteriana se ha atribuido a proteínas estructurales, incluyendo polisacáridos capsulares específicos de serotipo, lipopolisacáridos y proteínas de superficie, así como a toxinas citolíticas extracelulares. A pesar de la purificación y en algunos casos clonación, de estos factores de virulencia, el papel exacto de estos factores de virulencia en una infección de pleuroneumonía se entiende pobremente.

Se han identificado doce serotipos de A. pleuropneumoniae basándose en diferencias antigénicas en polisacáridos vasculares y en producción de toxinas extracelulares. Los serotipos 1, 5 y 7 son más relevantes para infección de A. pleuropneumoniae en los Estados Unidos, mientras que los serotipos 1, 2, 5, 7 y 9 son predominantes en Europa. Estas son al menos tres toxinas extracelulares significativas de A. pleuropneumoniae que son miembros de la familia de las hemolisinas y se refieren como toxinas RTX. Las toxinas RTX se producen por muchas bacterias gram

negativas, incluyendo E. coli, Proteus vulgarisa y Pasteurella haemolytica y las proteínas muestran generalmente características estructurales y funcionales. Las toxinas a partir de los diversos serotipos difieren, sin embargo, en especificidad de huésped, células objetivo y actividades biológicas.

Las toxinas de A. pleuropneumoniae RTX principales incluyen Apxl, Apxll y Apxlll. Apxl y Apxll tienen actividad hemolítica, con Apxl siendo más potente. Apxlll no muestra ninguna actividad hemolítica, pero es citotóxica para macrófagos alveolares y neutrófilos. La mayoría de los serotipos de A. pleuropneumoniae producen dos de estas tres toxinas. Por ejemplos, los serotipos 1, 5, 9 y 11 expresan Apxl y Apxll y los serotipos 2, 3, 4, 6 y 8 expresan Apxll y Apxlll. El serotipo 10, sin embargo, produce solo Apxl y serotipos 7 y 12 expresan solo Apxll. Aquellos serotipos de A. pleuropneumoniae que producen tanto Apxl como Apxll son las cepas más virulentas de las bacterias.

Las toxinas de Apx se demostró que eran factores de virulencia en modelos murinos e infección porcina usando bacterias de tipo silvestre mutadas al azar [Tascon y cois., Mol. Microbiol. 14: 207-216 (1994)]. Otros mutantes de A. pleuropneumoniae se han generado también con mutagénesis dirigida para inactivar el gen que codifica la proteína de virulencia de membrana exterior de AopA [Mulks y Buysee, Gene 165: 61-66 (1995)].

En intentos de producir composiciones de vacunas, las células bacterianas completas muertas tradicionales han proporcionado solo protección de serotipos [Maclnnes y Smart, supra], sin embargo, se ha demostrado que la infección natural con un serotipo altamente virulento puede estimular fuerte inmunidad protectora contra serotipos múltiples [Nielsen, Nord Vet Med. 31: 407-13 (1979), Nielsen, Nord Vet Med. 36: 221-234 (1984), Nielsen, Can J Vet Res. 29: 580-582 (1988); Nielsen, ACTA Vet Scand. 15: 80-89 (1994)]. Una cepa de vacuna atenuada viva definida que produce una forma inactiva de la toxina de Apxll ha mostrado promesa de protección cruzada en puercos [Prldeaux y cois., Infection & Immunity 67: 1962-1966 (1999)], mientras que otros mutantes atenuados vivos no definidos han mostrado también promesa [Inzana y cois., Infect Immun. 61: 1682-6 (1993); Paltineanu y cois., en International Pig Veterinary Society, 1992, p. 214; Utrera y cois., en International Pig Veterinary Society, 1992, p. 213].

Debido a los problemas asociados con formulaciones de vacuna que comprenden cepas bacterianas con mutaciones espontáneas, indefinidas, existe una necesidad en la técnica para construcción racional de cepas bacterianas atenuadas vivas para usar en vacunas que estimularán de forma segura la inmunidad protectora contra... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una bacteria atenuada de Pasteurella multocida, que comprende una mutación en un gen representado por una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido fhaC

(¡) en la que la secuencia polinucleotídica híbrida con el complemento de la SEC ID N.O: 19 en condiciones restrictivas, comprendiendo tales condiciones un lavado final en tampón que comprende SSC 2X/SDS al 0,1 %, a 35°C hasta 45°C, o

(¡i) en la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos idéntica en un 80 % a la SEC ID NO: 20, en la que la atenuación de la bacteria está causada por dicha mutación.

2. La bacteria de la reivindicación 1, en la que dicha mutación da como resultado la expresión disminuida de un producto génico codificado por el gen mutado.

3. La bacteria de la reivindicación 1, en la que dicha mutación da como resultado la expresión de un producto génico inactivo codificado por el gen.

4. La bacteria de la reivindicación 1, en la que dicha mutación da como resultado la deleción de todo o parte de dicho gen.

5. La bacteria de la reivindicación 1, en la que dicha mutación da como resultado una inserción en dicho gen.

6. La bacteria de la reivindicación 1, en la que la mutación está en la secuencia polinucleotídica de SEC ID NO: 19.

7. Una composición inmunogénica que comprende la bacteria de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Una composición vacunal que comprende una composición inmunogénica de la reivindicación 7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. La composición vacunal de la reivindicación 8, que comprende adicionalmente un coadyuvante.

10. Un polinucleótido purificado y aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que tiene SEC ID NO: 20.

11. El polinucleótido de la reivindicación 10, que comprende SEC ID NO: 19.

12. Un polipéptido purificado que comprende SEC ID NO: 20.


 

Patentes similares o relacionadas:

Complejos de hierro para la reducción de la colonización del tracto gastrointestinal por Campylobacter, del 8 de Mayo de 2019, de Akeso Biomedical Inc: Un compuesto para su uso en un método seleccionado de: un método para reducir el número de Campylobacter presente en el tracto gastrointestinal de un […]

Método de fabricación de una vacuna contra micoplasma, del 1 de Mayo de 2019, de BOEHRINGER INGELHEIM VETMEDICA GMBH: Un método para la preparación de una composición inmunogénica para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones por micoplasma en un sujeto que comprende: […]

Sistema de administración doble para antígenos heterólogos que comprende una cepa de Listeria recombinante atenuada por la mutación de dal/dat y la deleción de ActA que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de listeriolisina O - antígeno prostático específico, del 1 de Mayo de 2019, de Advaxis, Inc: Una cepa de Listeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión antigénico de listeriolisina O […]

Vacuna monodosis con Mycoplasma hyopneumoniae, del 10 de Abril de 2019, de Zoetis Services LLC: Uso de una bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae para la fabricación de una vacuna para el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno […]

Inmunógenos polisacáridos conjugados con proteínas portadoras de E. coli, del 5 de Abril de 2019, de GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA: Un conjugado de polisacárido que comprende un inmunógeno de polisacárido conjugado con un polipéptido portador, en el que el polipéptido portador es la proteína […]

Composiciones adyuvantes novedosas, del 3 de Abril de 2019, de Zoetis Services LLC: Una composición para su uso como una vacuna que comprende una formulación adyuvante y una cantidad terapéuticamente eficaz de un componente antígeno, en la que a) la formulación […]

Suministro multivalente de inmunomoduladores mediante ácidos nucleicos esféricos liposomales para aplicaciones profilácticas o terapéuticas, del 27 de Marzo de 2019, de Exicure, Inc: Una nanoestructura, que comprende un nucleo liposomal que tiene una bicapa lipidica, en donde un inmunoestimulador o un inmunosupresor estan asociados […]

Virus de la enfermedad de Marek recombinantes y usos de los mismos, del 27 de Marzo de 2019, de CEVA SANTE ANIMALE: Un virus de la enfermedad de Marek recombinante del serotipo 1 (MDV1) que comprende un promotor que consiste en el SEQ ID NO: 5 y bajo el […]

Otras patentes de la CIP G01N33/577