Anticuerpos contra la glicoproteína VI para el receptor de colágeno de plaquetas recombinante.

Antisuero anti-GPVI policlonal, Fab anti-GPVI obtenible a partir de dicho antisuero anti-GPVI,

o F(ab')2 anti-GPVI obtenible a partir de dicho antisuero anti-GPVI, en el que GPVI tiene la secuencia de SEC ID NO:3.

Anticuerpos contra la glicoproteína VI para el receptor de colágeno de plaquetas recombinante

La invención se refiere a la glicoproteína VI (GPVI), a su aislamiento, purificación, y a métodos para la producción recomblnante. Especialmente, la invención se refiere al uso de GPVI, preferiblemente GPVI recombinante, en el tratamiento de trastornos y sucesos patológicos correlacionados directa o indirectamente con trastornos de la coagulación sanguínea, tales como enfermedades trombóticas y cardiovasculares. La proteína recombinante extracelular también se puede usar para establecer ensayos de cribado para encontrar inhibidores potenciales de la GPVI unida a la membrana con el fin de inhibir la interacción de los trombocitos y el colágeno.

La glicoproteína VI es una glicoproteína de la membrana plaquetaria de 62/65 kDa (no reducida/reducida respectivamente), que forma un complejo junto con la subunidad común Fcy. La subunidad GPVI contiene el sitio de unión con el colágeno, y la subunidad Fcy es responsable de la señalización. El complejo forma uno de los principales receptores de colágeno en la superficie de las plaquetas, crítico para la activación plaquetaria en respuesta al colágeno. La secuencia de reconocimiento en el colágeno consiste en secuencias de (GlyProHyp)n'. Se conocen pacientes de Japón que tienen una deficiencia genética de GPVI. Tienen leves problemas de hemorragia, y sus plaquetas responden sólo débilmente al colágeno, presumiblemente mediante otros receptores. Se ha aprendido mucho acerca de las cascadas de señalización que se originan en la GPVI, las cuales se parecen mucho a las de receptores inmunitarios, incluyendo receptores de linfocitos T, receptores de células B y receptores de células asesinas naturales. Estas cascadas implican la familia src de tirosina cinasas tales como Fyn y Lyn, así como p72SYK y muchas otras tirosina cinasas y fosfatasas, y proteínas adaptadoras tales como LAT. Una diana principal de estas cascadas es la activación de la fosfolipasa Cy2 que desdobla fosfolípidos para dar los segundos mensajeros diacilglicerol e IP3. Se piensa que la GPVI está implicada en la activación de la integrina plaquetaria a2B1, que tiene un papel principal en la adhesión de las plaquetas a la pared de los vasos dañados. Los ratones con la subunidad Fcy "eliminada genéticamente" tienen plaquetas que aún muestran respuestas al colágeno, implicando que el estado de reposo de a2B1 también puede ser regulado por el complejo GPVI/Fcy.

La GPVI del receptor de colágeno plaquetario está estrechamente relacionada con los receptores activadores asesinos naturales de la familia p58KAR.

La adhesión y activación de plaquetas en reposo, circulantes, en un sitio de lesión vascular es la primera etapa en un proceso que conduce a la formación de un trombo, que se convierte en un tapón hemostático. El colágeno es uno de los componentes principales de la pared de los vasos, responsable de la activación de las plaquetas. Existen muchos tipos de colágeno, y siete de éstos se encuentran en las capas subendoteliales. Se han identificado en las plaquetas varios receptores diferentes para el colágeno, pero se considera ahora que los principales son la integrina GC2B1 y la GPVI no Integrina. Aunque la a2Bi está bien caracterizada y ambas subunidades se clonaron y secuenclaron hace varios años, la estructura de la GPVI ha permanecido difícil de averiguar, aunque se han Identificado varios rasgos. Se determinó, hace aproximadamente veinte años, que la GPVI es una glicoproteína plaquetaria Importante con una masa molecular en el intervalo de 60-65 kDa y un pl ácido. Su papel como receptor de colágeno putativo fue establecido después de la identificación de un paciente en Japón con un trastorno de hemorragia leve cuyas plaquetas mostraban un defecto específico de respuesta al colágeno y carecían de este receptor. Este paciente había desarrollado también autoanticuerpos para el receptor deficiente, y se usaron éstos para caracterizar la molécula adicionalmente. Más recientemente, se estableció que la GPVI está asociada de manera no covalente con la subunidad común Fcy, la cual actúa como la parte señalizadora del complejo. También se demostró que la secuencia de reconocimiento en el colágeno para la GPVI es un triplete Gly-Pro-Hyp repetido dentro de la estructura helicoidal triple del colágeno, y que se podrían usar péptidos sintéticos basados en esta estructura como agonistas específicos dirigidos a la GPVI. Se mostró que el complejo GPVI/Fcy señaliza hacia el interior de las plaquetas mediante un mecanismo similar a un receptor ¡nmunltarlo, que implica la activación de p72SYK y que conduce mediante una cascada de Interacciones clnasa/fosfatasa/proteína adaptadora a la activación de PLCy2 y por tanto a la liberación de gránulos y agregación plaquetaria. Una etapa adicional en la caracterización de esta molécula fue la demostración de que la lectlna de tipo C de serpiente, convulxlna, de la Serpiente de Cascabel Tropical, Crotalus durissus terrificus, fue capaz de activar plaquetas agrupando GPVI mediante una interacción multimérica. Se mostró que la convulxlna se une de manera específica a la GPVI, proporcionando un método para la purificación de este receptorjunto con los enfoques establecidos.

Sugiyama et al. (Blood 69 (1987) 1712-1720) describen un nuevo factor agregador de plaquetas. Este factor se ha encontrado en un paciente con trombocitopenia autolnmunltarla. El factor es el IgG del paciente o sus fragmentos Fab o F(ab)2. Los fragmentos F(ab)2 indujeron agregación Irreversible en plasma normal rico en plaquetas. Además, los fragmentos Fab inhibieron específicamente la agregación Inducida por colágeno y por el IgG del paciente. El componente principal de un inmunoprecipitado obtenido con el IgG del paciente a partir de proteínas de membrana radiomarcadas de extracto plaquetario normal tuvo un peso molecular de 62 kDa.

Sugiyama et al. (International Journal of Hematology 58 (1993) 99-104) examinaron el papel funcional de P62, el antígeno reconocido por el fragmento Fab de IgG aislado del paciente con trombocitopenia autolnmunltarla. Se describe que la plaqueta del paciente mostró adherencia normal a colágeno, y que el fragmento Fab inhibió la adhesión plaquetaria normal a colágeno de una manera dependiente de la dosis.

Ichinohe et al. (The Journal of Blological Chemistry 270 (1995) 28029-28036) examinaron el papel de la proteína GPVI usando los fragmentos F(ab)2 del IgG del paciente con trombocltopenla autoinmunitaria. El acoplamiento de GPVI se acopla a la activación de c-Src y Syk, insensible a cAMP, acompañado de fosforilación de tirosina de numerosos sustratos, incluyendo fosfolipasa C-y2, de una manera similar a la estimulación de colágeno.

Gibbins et al. (FEBS Letters 413 (1997) 255-259) describen que GPVI es el receptor de colágeno en plaquetas que acopla la estimulación de plaquetas por colágeno a la fosforilación tirosínica de la cadena y del receptor de Fe. Los autores usan fragmentos F(ab)2 antl-GPVI del IgG del paciente con trombocltopenla autoinmunitaria.

Jandrot-Perrus et al. (The Journal of Biological Chemistry 272 (1997) 27035-27041) describen la adhesión y activación de plaquetas humanas Inducidas por convulxlna. La adhesión y activación implica GPVI e integrina alfa2beta1. La exocitosis y agregación plaquetarias inducidas por convulxlna se Inhibieron por los fragmentos Fab del IgG del paciente con trombocltopenla autoinmunitaria.

Ezumi et al. (The Journal of Experimental Medicine 188 (1998) 267-276) Investigaron la Implicación de la familia de Src en las señales proximales a través del complejo GPVI-FcRy usando convulxlna y fragmentos F(ab)2 anti-GPVI del IgG del paciente con trombocltopenla autoinmunitaria. Los resultados Indicaron que la familia de Src desempeña un papel crítico en la activación plaquetarla vía el complejo del receptor de colágeno GPVI-FcRy.

Heemskerk et al. (Thrombosls and Haemostasis, Schattauer GmbH 81 (1999) 782-792) describen la función de GPVI e integrina alfa2beta1 en la respuesta procoagulante de plaquetas adherentes a colágeno Individuales. Los autores usan IgG anti-GPVI y los fragmentos Fab correspondientes del IgG del paciente con trombocitopenia autoinmunitaria.

Ishibashi et al. (International Journal of Hematoloy 62 (1995) 107-115) Identificaron la molécula 2 de adhesión intercelular (ICAM-2) usando el anticuerpo del paciente con trombocltopenla autoinmunitaria en una técnica de inmunoprecipitación mejorada. La molécula ICAM-2 tiene un peso molecular de alrededor de 62 kDa.

El documento EP 0.896.002 se refiere a proteínas quiméricas que consisten en una integrina y una inmunoglobulina, a sus complejos heterodímeros, a un... [Seguir leyendo]

1. Antisuero anti-GPVI policlonal, Fab anti-GPVI obtenible a partir de dicho antisuero anti-GPVI, o F(ab)2 anti-GPVI obtenible a partir de dicho antisuero anti-GPVI, en el que GPVI tiene la secuencia de SEC ID NO:3.

2. Antisuero anti-GPVI policlonal, Fab anti-GPVI obtenible a partir de dicho antisuero anti-GPVI, o F(ab)2 anti-GPVI 5 obtenible a partir de dicho antisuero anti-GPVI según la reivindicación 1, en el que GPVI se puede obtener a partir de

plaquetas usando aglutinina de germen de trigo y convulxina y aplicando electroforesis en gel sobre poliacrilamida de alrededor de 8,5%.

3. Antisuero anti-GPVI policlonal, Fab anti-GPVI obtenible a partir de dicho antisuero anti-GPVI, o F(ab)2 obtenible a partir de dicho antisuero anti-GPVI según la reivindicación 1 ó 2, en el que el antisuero anti-GPVI policlonal se

genera en conejos.

4. Fragmento Fab anti-GPVI de anticuerpos monoclonales de ratón humanizados frente a GPVI, en el que GPVI tiene la secuencia de SEC ID NO: 3.

5. Anticuerpos monoclonales o policlonales que reconocen la región N-terminal de GPVI, en el que GPVI tiene la secuencia de SEC ID NO: 3.