Análogos de oligonucleótidos modificados con fosfato con actividad inmunoestimulante.

Un oligonucleótido inmunoestimulante que tiene al menos un dinucleótido purina-pirimidina modificado,

de acuerdo con la Fórmula I**Fórmula**

en la que

R es hidrógeno (H), C1-C4 alquilo, metoxietil, pivaloil oximetil, pivaloil oxibenzil, o S-pivaloil tioetil o una sal tolerada fisiológicamente de los mismos; X, Y y Z son oxígeno (O) o azufre (S); R1 y R2 son H o C1-C2 alquilo;

Py es un nucleósido o un análogo de nucleósido con una base citosina y Pu es un nucleósido o un análogo de nucleósido con una base guanina, por lo que el oligonucleótido inmunoestimulante es un ligando TLR9, y en donde el oligonucleótido es ADN.

Análogos de oligonucleótidos modificados con fosfato con actividad inmunoestimulante Campo de la invención La invención se refiere a oligonucleótidos que tienen al menos un fosfonoacetato o enlace de tipo fosfonoacetato como se desvela en la reivindicación 1.

Antecedentes y métodos de uso El ADN bacteriano tiene efectos inmunoestimulantes para activar células B y células citolíticas naturales, pero no pasa con el ADN de vertebrados (Tokunaga, T., et al., 1988. Jpn. J. Cancer Res. 79:682-686; Tokunaga, T., et al., 1984, JNCI 72:955-962; Messina, J.P. et al., 1991, J. Immunol. 147:1759-1764; y revisado en Krieg, 1998, en: Applied Oligonucleotide Technology, C.A. Stein and A.M. Krieg, (Eds.) , John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, pp. 431-448) . Se entiende ahora que estos efectos inmunoestimulantes del ADN bacteriano son el resultado de la presencia de dinucleótidos CpG no metilados en particulares contextos de bases (motivos CpG) , que son comunes en el ADN bacteriano, pero están metilados y bajo-representados en el ADN de vertebrados (Krieg et al., 1995 Nature 374:546-549; Krieg, 1999 Biochim. Biophys. Acta 93321:1-10) .Los efectos inmunoestimulantes del ADN bacteriano puede imitarse con oligodesoxinucleótidos sintéticos (ODN) que contienen estos motivos CpG. Tales ODN CpG tienen efectos altamente estimulantes en leucocitos humanos y murinos, induciendo la proliferación de células B; secreción de citoquinas e inmunoglobulinas; actividad de lisis de las células citolíticas naturales y secreción de IFN-; y activación de células dendríticas (DC) y otras células presentadoras de antígenos para expresar moléculas co-estimulantes y segreguen citoquinas, especialmente citoquinas tipo T1 que son importantes en la promoción del desarrollo de respuestas de células T tipo T1. Estos efectos inmunoestimulantes del armazón fosfodiéster nativo de ODN CpG son altamente específicos de CpG ya que los efectos se reducen drásticamente si el motivo CpG se metila, se cambia a un GpC, o se elimina o altera de otra manera (Krieg et al., 1995 Nature 374:546-549; Hartmann et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10) .

En los estudios tempranos, se pensaba que el motivo CpG inmunoestimulante seguía la fórmula purina-purina-CpGpirimidina-pirimidina (Krieg et al., 1995 Nature 374:546-549; Pisetsky, 1996 J. Immunol. 156:421-423; Hacker et al., 1998 EMBO J. 17:6230-6240; Lipford et al., 1998 Trends in Microbiol. 6:496-500) . Sin embargo, ahora está claro que los linfocitos del ratón responden bastante bien a los motivos CpG fosfodiéster que no siguen esta "fórmula" (Yi et al., 1998 J. Immunol. 160:5898-5906) y lo mismo es cierto para las células B y células dendríticas humanas (Hartmann et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10; Liang, 1996 J. Clin. Invest. 98:1119-1129) .

Se han hecho varias modificaciones en el armazón fosfodiéster de los oligonucleótidos inmunoestimulantes. Las modificaciones en el fósforo han incluido especies neutras así como especies cargadas positiva y negativamente tales como especies de fosforotioato (PS) . Los oligonucleótidos PS muestran una buena actividad inmunoestimulantes que solo es superada por los ODN semi-blandos, en que el enlace internucleótido en CpG es un enlace fosfodiéster (PO) . Se asume generalmente que los sustituyentes en el átomo de fosforo debe tener carga y tamaño similar para obtener una actividad comparable.

El documento WO 2006/116458 desvela oligorribonucleótidos CpG modificados con un aumento de actividad inmunoestimulante. Los ORN se degradan rápidamente y son lábiles a las nucleasas. El documento WO 2006/116458 proporciona oligorribonucleótidos modificados químicamente y análogos de ORN que se caracterizan por una mejor estabilidad frente a las nucleasas y su mejor actividad biológica (p. 4, l. 11-20) . Los ORN modificados con fosfonoacetato y también el enlace fosfonocarboxilato internucleótido se proponen en la fórmula (I) No se dan ejemplos para los ODN con dicha modificación del armazón.

Sumario La invención se refiere a un oligonucleótido que comprende una o más modificaciones que provoca una capacidad inmunoestimulante aumentada. En particular, la invención se basa en el hallazgo de que los oligonucleótidos que tienen al menos motivo pirimidina-purina (Py-Pu) que corresponde con la fórmula (posteriormente) son altamente eficaces en la mediación de una respuesta inmunitaria. Estos oligonucleótidos son útiles terapéutica y profilácticamente para inducir una respuesta inmunitaria y para tratar enfermedades y trastornos tales como el cáncer e infecciones víricas.

En un aspecto, la invención es una composición que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante que tiene al menos un dinucleótido pirimidina-purina modificado de acuerdo con la Fórmula I:

** (Ver fórmula) **

donde R es hidrógeno (H) , C1-C4-alquilo, metoxietil, pivaloil oximetil, pivaloil oxibenzil, o S-pivaloil tioetil o una sal fisiológicamente tolerada de los mismos; X, Y y Z son oxígeno (O) o azufre (S) ; R1 y R2 son H o C1-C2-alquilo; Py es un nucleósido o análogo de nucleósido con una base de citosina; Pu es un nucleósido o análogo de nucleósido con una base de guanina, por el que el oligonucleótido es un ligando TLR9, y en que el oligonucleótido es ADN.

En algunas realizaciones, el oligonucleótido comprende además un segundo dinucleótido pirimidina-purina, en que el segundo dinucleótido pirimidina-purina tiene un enlace fosforotioato. En otra realización el oligonucleótido inmunoestimulante comprende al menos un segundo dinucleótido pirimidina-purina, en que el segundo dinucleótido pirimidina-purina tiene un enlace fosfodiéster. En otra realización más, el dinucleótido inmunoestimulante comprende además al menos un segundo dinucleótido pirimidina-purina, en que el segundo dinucleótido pirimidina-purina tiene un enlace fosforotioato y además comprende al menos un tercer dinucleótido pirimidina-purina, en que el tercer dinucleótido pirimidina-purina tiene un enlace fosfodiéster.

En algunas realizaciones al menos un nucleótido del oligonucleótido inmunoestimulante tiene un resto de azúcar modificado que se selecciona de entre el grupo que consiste esencialmente de 2-fluoro-2-desoxirribosa, 2-amino2-desoxirribosa, 2-O-alquil-ribosa, o 3-O-alquil-ribosa. En algunas realizaciones el oligonucleótido inmunoestimulante contiene al menos una enlace internucleótido que se selecciona de entre el grupo que consiste en enlaces 2-5, 5-5, 3-3, 2-2, o 2-3. En algunas realizaciones el oligonucleótido inmunoestimulante es un oligonucleótido de clase B, clase C, clase P, clase T, o clase E.

En algunas realizaciones la composición comprende además un agente antibacteriano, un agente anti-cáncer, un agente antivírico, un medicamento para el asma o la alergia, o un medicamento para una enfermedad autoinmunitaria. En otra realización uno o más de los dinucleótidos pirimidina-purina es un dinucleótido C-G. En una realización el segundo dinucleótido pirimidina-purina es un dinucleótido C-G. En otra realización más, el oligonucleótido inmunoestimulante incluye al menos dos dinucleótidos C-G. En otra realización más, el oligonucleótido inmunoestimulante incluye al menos tres dinucleótidos C-G. En una realización el oligonucleótido inmunoestimulante incluye al menos un enlace internucleótido fosforotioato. En otra realización el oligonucleótido inmunoestimulante incluye al menos un enlace internucleótido fosfodiéster. En algunas realizaciones el oligonucleótido inmunoestimulante se formula con un antígeno.

Otro aspecto de la invención proporciona una composición que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante como se define en las reivindicaciones, que tiene al menos un enlace internucleótido fosfonoacetato o de tipo fosfonoacetato, en que la estructura del oligonucleótido es quimérica, y un vehículo farmacéutico para su uso como un medicamento para estimular una respuesta inmunitaria. En una realización, el sujeto tiene una infección bacteriana y la composición se administra en una cantidad eficaz para tratar la infección bacteriana. En otra realización, el sujeto que se va a tratar tiene una alergia y la composición se administra en una cantidad eficaz para tratar la alergia. En otra realización más, la composición se administra en una cantidad eficaz para tratar el asma. En otra realización más el sujeto tiene una enfermedad autoinmunitaria y la composición se administra en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad autoinmunitaria.

En una realización el oligonucleótido inmunoestimulante es uno cualquiera o más de los oligonucleótidos inmunoestimulantes descritos en el presente documento. En realizaciones particulares el oligonucleótido inmunoestimulante... [Seguir leyendo]

1. Un oligonucleótido inmunoestimulante que tiene al menos un dinucleótido purina-pirimidina modificado, de acuerdo con la Fórmula I

** (Ver fórmula) **

en la que R es hidrógeno (H) , C1-C4 alquilo, metoxietil, pivaloil oximetil, pivaloil oxibenzil, o S-pivaloil tioetil o una sal tolerada fisiológicamente de los mismos; X, Y y Z son oxígeno (O) o azufre (S) ; R1 y R2 son H o C1-C2 alquilo; Py es un nucleósido o un análogo de nucleósido con una base citosina y Pu es un nucleósido o un análogo de nucleósido con una base guanina, por lo que el oligonucleótido inmunoestimulante es un ligando TLR9, y en donde el oligonucleótido es ADN.

2. El oligonucleótido inmunoestimulante de la reivindicación 1 en donde el oligonucleótido incluye una estructura que es quimérica.

3. El oligonucleótido inmunoestimulante de la reivindicación 1 que comprende además al menos un segundo

dinucleótido pirimidina-purina, en donde el segundo dinucleótidos pirimidina-purina tiene un enlace fosfodiéster o un enlace fosforotioato y además comprende al menos un tercer dinucleótido pirimidina-purina, en donde el tercer dinucleótido pirimidina-purina tiene un enlace fosfodiéster.

4. El oligonucleótido inmunoestimulante de la reivindicación 1, en donde al menos un nucleótido del oligonucleótido inmunoestimulante tiene un resto de azúcar modificado que se selecciona de entre el grupo que consiste esencialmente e.

2. fluoro-2-desoxiribosa.

2. amino-2-desoxirribosa.

2. O-alquil-ribosa.

2. O-metil-ribosa.

2. amino2-desoxirribosa.

2. O-4-C-alquileno ribosa .

3. O-alquil-ribosa.

5. El oligonucleótido inmunoestimulante de la reivindicación 1 en donde el oligonucleótido inmunoestimulante contiene al menos un enlace internucleótido seleccionado de entre el grupo que consiste en enlace.

2. 5.

5. 5.

3. 3.

2. 2, .

2. 3.

6. El oligonucleótido inmunoestimulante de la reivindicación 1 que además comprende un antígeno, un agente antibacteriano, un agente anticáncer, un agente antivírico, un medicamento para el asma o la alergia, o un 35 medicamento para una enfermedad autoinmunitaria.

7. El oligonucleótido inmunoestimulante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho al menos un dinucleótido modificado pirimidina-purina de acuerdo con la Fórmula I es un dinucleótido C-G que tiene un enlace internucleótido fosfonoacetato.

8. El oligonucleótido inmunoestimulante de la reivindicación 1, que tiene una secuencia que se selecciona de entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 8-11, 15, 17-21 .

2. 32.

9. Una composición que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante de acuerdo con la reivindicación 1 que

tiene al menos un enlace internucleótido fosfonoacetato o de tipo fosfonoacetato, en donde la estructura del oligonucleótido es quimérica, y un vehículo farmacéutico para su uso como un medicamento para estimular una respuesta inmunitaria.

10. El oligonucleótido inmunoestimulante de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéutico para su uso en el 50 tratamiento del cáncer.

11. El oligonucleótido inmunoestimulante de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéutico para su uso en el tratamiento de una infección.

12. Una composición que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene al menos un enlace internucleótido de tipo fosfonoacetato, en donde la estructura del oligonucleótido es quimérica y un vehículo farmacéutico para su uso en el tratamiento del asma.

13. Una composición que comprende una oligonucleótido inmunoestimulante de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene al menos un enlace internucleótido de tipo fosfonoacetato, en donde la estructura del oligonucleótido es quimérica y un vehículo farmacéutico para su uso en el tratamiento de la alergia.

14. Una composición que comprende:

un oligonucleótido inmunoestimulante de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene al menos un enlace fosfonoacetato o de tipo fosfonoacetato, y en que la matriz del oligonucleótido es quimérica, en donde el oligonucleótido se une al menos a un agente terapéutico.

15. La composición de la reivindicación 14, en donde el agente terapéutico es un segundo oligonucleótido y el segundo oligonucleótido está unido al oligonucleótido inmunoestimulante para formar una estructura ramificada.

16. La composición de la reivindicación 14, en donde el agente terapéutico es un segundo oligonucleótido y el 15 segundo oligonucleótido está unido al oligonucleótido inmunoestimulante para formar un enlac.

3. 3.

17. La composición de la reivindicación 14, en donde el agente terapéutico es un segundo oligonucleótido y el segundo oligonucleótido y el oligonucleótido inmunoestimulante forman dendrímeros.