Uso de p97 como sistema de administración de enzimas para la administración de enzimas lisosómicas terapéuticas.

Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad de almacenamiento lisosómico;

comprendiendo dicha composición una molécula de p97 unida covalentemente a una proteína cuya deficiencia provoca la enfermedad; en donde la proteína está seleccionada de entre el grupo que consiste en a-L-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, heparan-N-sulfatasa, a-N-acetilglucosaminidasa, arilsulfatasa A, galactosilceramidasa, a-glucosidasa ácida, tioesterasa, hexosaminidasa A, esfingomielinasa ácida y a- galactosidasa; y en donde la composición se administra a un lisosoma en una célula del sujeto.

Uso de p97 como sistema de administración de enzimas para la administración de enzimas lisosómicas terapéuticas

Campo de la invención

La presente memoria descriptiva está relacionada con el campo de la farmacia y específicamente con el tratamiento de enfermedades a través de la introducción en un sujeto de la proteína o polipéptido p97 conjugado con un agente terapéutico o de diagnóstico. En particular, esta memoria descriptiva se refiere a conjugados de p97 y proteínas deficientes en una enfermedad de almacenamiento lisosómico y métodos para el tratamiento, la mejora o la prevención de enfermedades de almacenamiento lisosómico mediante la administración de los conjugados a sujetos afectados por tales enfermedades.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades de almacenamiento lisosómico (EAL) surgen como resultado de la ausencia o reducción de la actividad de enzimas específicas dentro de los lisosomas de una célula. Se ha identificado un gran número de estas enzimas y se han correlacionado con sus enfermedades relacionadas. Una vez identificada la enzima ausente o deficiente, el tratamiento se puede reducir al problema de administrar una enzima de reemplazo (fármaco) a los tejidos afectados de un paciente. Dentro de las células, el efecto de la enzima ausente se puede observar como una acumulación de "material de almacenamiento" no degradado dentro del lisosoma intracelular. Esta acumulación provoca que los lisosomas se hinchen y funcionen mal, lo que se traduce en daño celular y tisular. Puesto que las enfermedades de almacenamiento lisosómico típicamente tienen una etiología genética, muchos tejidos carecerán de la enzima en cuestión. Sin embargo, diferentes tejidos sufren la ausencia de la misma enzima de manera diferente. La magnitud de la afectación adversa de un tejido viene determinada, en cierta medida, por el grado en el que el tejido genere el sustrato de la enzima ausente. Los tipos de tejido que soportan la mayor carga del almacenamiento, a su vez, dictan cómo se debe administrar el fármaco al paciente. Mientras que la terapia de reemplazo enzimático (TRE) por vía intravenosa resulta beneficiosa para la EAL (por ejemplo, MPS I, MPS II) , contar con medios para la mejora de la administración de la enzima terapéutica a los lisosomas en estas enfermedades resultaría ventajoso en términos de reducción de costes y aumento de la eficacia terapéutica.

Además, la barrera hematoencefálica (BHE) bloquea la libre transferencia de muchos agentes de la sangre al cerebro. Por esta razón, no se espera que las EAL que presentan una afectación neurológica significativa (por ejemplo, MPS III, MLD, GM1) sean tan sensibles a la TRE intravenosa. Para tales enfermedades, sería altamente deseable disponer de un método de administración de la enzima a través de la BHE y hasta los lisosomas de las células afectadas.

A principios de los 1980, se identificó la melanotransferrina (MTf) o p97 como un antígeno oncofetal que o bien no se expresa o solo se expresa ligeramente en los tejidos normales, pero que se encuentra en cantidades mucho más grandes en las células neoplásicas (en particular en las células de melanoma malignas) y en los tejidos fetales (Woodbur y , y cols., P.N.A.S. USA, 77:2183-2187 (1980) ) . Más recientemente, se han documentado informes adicionales que describen la identificación de la MTf humana en tejidos normales, tales como los conductos de las glándulas sudoríparas, las células endoteliales del hígado, y el endotelio y la microglía reactiva del cerebro (Jefferies, y cols., Brain Res., 712:122-126 (1996) ; and Rothenberger, y cols., Brain Res., 712:117-121 (1996) ) .

Curiosamente, el suero normal contiene niveles muy bajos de MTf soluble circulante, pero se ha encontrado un aumento de la MTf sérica soluble en pacientes con enfermedad de Alzheimer avanzada (Kennard, y cols., Nat. Med., 2:1230-1235 (1996) ; patente de EE.UU. nº 5981194) .

Ha resultado difícil de elucidar la función bioquímica y el metabolismo de la MTf. A juzgar por su aspecto, la MFt es engañosamente similar a la transferrina (Tf) y a la lactotransferrina (lactoferrina o Lf) . En los seres humanos, estas proteínas comparten una homología de la secuencia de aminoácidos del 37-39 %. En particular, cada una de estas proteínas se une reversiblemente al hierro, y sus dominios N-terminales de unión al hierro son bastante similares (Baker, y cols., TIBS, 12:350-353 (1987) ) .

Sin embargo, no se ha confirmado la existencia de paralelismos funcionales entre estas proteínas. Por un lado, a diferencia de la Tf y la Lf, la MTf existe tanto en forma unida a la membrana como en forma soluble en suero. Además, en contraste con la Tf y la Lf, no se ha identificado receptor celular para la MTf. Se sabe que la Tf soluble en suero es absorbida por las células en un proceso dependiente de la energía mediado por el receptor de la transferrina (Tf-R) (Cook, y cols., Annu. Rev. Med., 44:63-74) (1993) ) . Asimismo, es probable que la internalización de la Lf esté mediada por un proceso mediado por receptor (Fillebeen, y cols., J. Biol. Chem., 274 (11) :701-7017 (1999) ) . Dos receptores conocidos para la Lf son LRP-1 y RAGE, aunque podrían existir otros (Melinger, y cols., FEBS Letters, 360:70-74 (1995) ; Schmidt, J. Biol. Chem., 269 (13) :9882-9888 (1994) .

Con respecto al sistema nervioso central (por ejemplo, cerebro, médula espinal) , existen al menos tres formas de 65 mejorar la administración: inyección, permeabilización de la BHE y modificación del fármaco. La inyección directa implica la inyección del fármaco en el tejido cerebral, evitando por completo la vasculatura. Este método adolece

principalmente del riesgo de complicaciones (infección, daño tisular) relacionado con las inyecciones intracraneales. Este riesgo se agrava cuando se considera en el contexto de una pauta de tratamiento regular aplicada a lo largo de la vida del paciente. También resulta difícil, usando un número limitado de inyecciones en un único sitio, lograr la misma penetración que los vasos sanguíneos (y por lo tanto, potencialmente, los fármacos) tienen en todo el cerebro.

El segundo método consiste en alterar la BHE de forma no específica mediante la inyección concomitante de fármacos por vía intravenosa. La permeabilización de la BHE se lleva a cabo químicamente. Este método adolece de una falta de especificidad. Todos aquellos componentes de la sangre que quedan necesariamente excluidos por la BHE entrarán en el cerebro junto con el fármaco. En estas condiciones, el cerebro se vuelve vulnerable y es previsible que se produzcan daños en el transcurso de una pauta de tratamiento durante toda la vida.

El tercer medio de aumento de la disponibilidad cerebral del fármaco transportado por la sangre implica la funcionalización específica del fármaco con radicales que faciliten el transporte a través de una BHE no alterada.

Este método tiene las ventajas de lograr una infiltración específica en la BHE y de una cómoda administración intravenosa. En la patente de EE.UU. nº 6455494 se muestra un método para aumentar la capacidad de un agente terapéutico para cruzar la barrera hematoencefálica, y se describe el uso de p97 como vehículo para administrar un fármaco terapéutico a través de la barrera hematoencefálica.

La p97 (melanotransferrina) es una proteína humana natural. La p97 fue descubierta y caracterizada como un marcador de la superficie celular del melanoma humano (antígeno asociado al melanoma) , pero más recientemente se ha encontrado en otros tipos de tumores, así como en el cerebro humano normal y en el tejido hepático, en cantidades traza en otros tejidos del cuerpo y en el suero. Se desconoce la función de p97 en el cuerpo, pero a juzgar por su estructura y propiedades de unión, que se cree que está implicada en el transporte de iones metálicos (por ejemplo, hierro) hasta las células. Jefferies, y cols. han estado trabajando con la p97 desde 1992 (patente de EE.UU. nº 5981194) . Estas investigaciones se han centrado en la p97 como marcador de diagnóstico para la enfermedad de Alzheimer (EA) . Synapse ha desarrollado una prueba en sangre (suero) para la EA que se basa en el descubrimiento de que la concentración sérica de la p97 aumenta a medida que avanza la enfermedad. Durante el desarrollo de esta prueba, se descubrió que la p97 se transporta de forma activa desde la sangre hacia el tejido cerebral de los individuos normales. Este descubrimiento fue el impulso para el desarrollo de la p97 como posible sistema de transporte para administrar moléculas desde la sangre, a través de la BHE, para llegar hasta los líquidos intersticiales cerebrales.

El acontecimiento clave para la administración... [Seguir leyendo]

1. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad de almacenamiento lisosómico; comprendiendo dicha composición una molécula de p97 unida covalentemente a una proteína cuya deficiencia provoca la enfermedad; en donde la proteína está seleccionada de entre el grupo que consiste en α-L-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, heparan-N-sulfatasa, α-N-acetilglucosaminidasa, arilsulfatasa A, galactosilceramidasa, α-glucosidasa ácida, tioesterasa, hexosaminidasa A, esfingomielinasa ácida y αgalactosidasa; y en donde la composición se administra a un lisosoma en una célula del sujeto.

2. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el sujeto es humano.

3. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que la composición se usa por vía intravenosa.

4. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la molécula de p97 es p97 humana.

5. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la molécula de p97 es p97 soluble. 20

6. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la proteína es α-L-iduronidasa 7. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la 25 proteína es iduronato-2-sulfatasa.

8. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la molécula de p97 está unida covalentemente a la proteína por un enlazador extendido.

9. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el conjugado es una proteína de fusión de p97 y de la proteína.

10. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el sujeto sufre manifestaciones neurológicas de la enfermedad. 35

11. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la composición comprende el conjugado en una cantidad terapéuticamente eficaz.

12. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que la

enfermedad se selecciona entre el grupo compuesto por mucopolisacaridosis I (MPS I) , MPS II, MPS IIIA, MPS IIIB, leucodistrofia metacromática (LDM) , Krabbe, Pompe, CLN2, Tay-Sachs y Niemann-Pick A y B.

13. Un uso de un compuesto que comprende una molécula de p97 unida covalentemente a una proteína cuya deficiencia provoca una enfermedad de almacenamiento lisosómico en la fabricación de un medicamento para el 45 tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad de almacenamiento lisosómico; en donde la proteína se selecciona de entre el grupo que consiste en α-L-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, heparan-N-sulfatasa, α-Nacetilglucosaminidasa, arilsulfatasa A, galactosilceramidasa, α-glucosidasa ácida, tioesterasa, hexosaminidasa A, esfingomielinasa ácida y α-galactosidasa; y en donde el medicamento se administra a un lisosoma en una célula del sujeto.

14. El método de la reivindicación 13, en el que la proteína es α-L-iduronidasa.

15. El uso de la reivindicación 13 ó 14, en el que la molécula de p97 es p97 soluble.

16. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que el compuesto es una proteína de fusión de la molécula de p97 y la proteína.

17. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que la molécula de p97 está unida covalentemente a la proteína por un enlazador extendido. 60

18. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en el que el conjugado es capaz de pasar a través de la barrera hematoencefálica y entrar en un lisosoma de una célula del sistema nervioso central.

19. Un método de detección de la actividad terapéutica de un compuesto en el tratamiento de una enfermedad de 65 almacenamiento lisosómico, comprendiendo dicho método:

poner en contacto una célula que tiene un lisosoma in vitro con el compuesto, en donde el compuesto comprende p97 unida covalentemente a una proteína deficiente en una enfermedad de almacenamiento lisosómico; en donde la proteína se selecciona entre el grupo formado por α-L-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, heparan-N-sulfatasa, α-N

acetilglucosaminidasa, arilsulfatasa A, galactosilceramidasa, α-glucosidasa ácida, tioesterasa, hexosaminidasa A, esfingomielinasa ácida y α-galactosidasa; y el seguimiento de la administración del compuesto al lisosoma.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el compuesto está marcado y el seguimiento detecta el marcador. 10

21. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en el que la célula es humana.

22. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en el que la célula es deficiente en la proteína.

23. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en el que el seguimiento se realiza determinando el efecto del compuesto sobre el material de almacenamiento lisosómico.

24. Una composición farmacéutica para uso en la administración de una proteína a una célula en un sujeto que tiene una enfermedad de almacenamiento lisosómico; comprendiendo dicha composición una cantidad terapéuticamente 20 eficaz de un compuesto que comprende una molécula de p97 unida covalentemente a una proteína cuya deficiencia provoca una enfermedad de almacenamiento lisosómico y un excipiente farmacéuticamente aceptable; en donde la proteína está seleccionada de entre el grupo formado por α-L-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, heparan-Nsulfatasa, α-N-acetilglucosaminidasa, arilsulfatasa A, galactosilceramidasa, α-glucosidasa ácida, tioesterasa, hexosaminidasa A, esfingomielinasa ácida y α-galactosidasa; y en donde el compuesto se administra a un lisosoma en una célula del sujeto.

25. La composición de acuerdo con la reivindicación 24, en la que el sujeto sufre manifestaciones neurológicas de la enfermedad.