Uso de enzimas de restricción como marcadores moleculares para el diagnóstico de la Tricuriasis humana y otras Tricuriasis de origen animal.

Uso de enzimas de restricción como marcadores moleculares para el diagnóstico de la Tricuriasis humana y otras Tricuriasis de origen animal consistente en un procedimiento específico basado en marcadores moleculares para diferenciar qué especie de Trichuris está infectando al hombre,

o qué especie de Trichuris está presente en cualquier muestra de heces, aguas, u otras; para aplicarse al diagnóstico, epidemiología, control y profilaxis, y tratamiento de la Tricuriasis humana y animal.

Uso de enzimas de restricción como marcadores moleculares para el diagnóstico de la Tricuriasis humana y otras Tricuriasis de origen animal.

OBJETO DE LA INVENCIÓN

El objeto de la invención, según se expresa en el enunciado de esta memoria descriptiva, es la utilización de un procedimiento de diferenciación específica del género Trichuris basado en marcadores moleculares específicos para aplicarse al diagnóstico, epidemiología, control y profilaxis, y tratamiento de la tricuriasis humana y animal.

El área científica a la que corresponde la invención sería la de "Parasitología molecular" y el Sector de Actividad sería prioritariamente en el sector farmacéutico y, en general, en el sector sanitario. Es decir, la misma sería aplicable en el campo de la sanidad para el diagnóstico de la tricuriasis, en el campo de la epidemiología para llevar a cabo estudios de prevalencia, incidencia, zoonosis, así como en la detección de huevos de Trichuris en el análisis de aguas residuales, en vistas a poder llevar unas mejores y fiables medidas de control, así como en el campo de la industria farmacéutica para la elaboración de nuevas terapias (vacunas) para la tricuriasis y en terapias de la enfermedad de Crohn.

ANTECEDENTES EN EL ESTADO DE LA TÉCNICA

Los parasitismos gastrointestinales por helmintos son considerados como las infecciones parásitas más comunes. De hecho, más de un cuarto de la población mundial se encuentra infectada, siendo, de las infecciones humanas crónicas de cualquier tipo, la más prevalente. La mayoría de estas infecciones son atribuidas a cuatro especies de nematodos, cada una de ellas infecta a cientos de millones de personas. Estas especies, en orden de abundancia, son: Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanus y Ancylostoma duodenale. Aunque la extraordinaria abundancia de estos nematodos se ha investigado ampliamente durante muchos años, el reconocimiento global de la importancia sanitaria de estas infecciones no se estableció hasta 1980, en que la

Organización Mundial de la Salud (OMS) reactivó un programa de investigación y control de estas infecciones helmínticas gastrointestinales.

Las especies del género Trichuris son nematodos parásitos del ciego de distintos hospedadores. Presentan un ciclo biológico directo; una vez que el gusano se asienta en el epitelio de la luz intestinal, empieza a madurar y crece, mudando a través de cuatro estados larvarios hasta adulto. En este estado, el gusano penetra en el epitelio por su parte anterior quedando el final posterior libre en el lumen. El gusano adulto parece alimentarse de material enterocítico y sangre, siendo responsable de una enfermedad en el hombre conocida como tricuriasis. La tricuriasis es un parasitismo que afecta a un billón de personas en el mundo a través de áreas templadas y tropicales. Su agente etiológico, Trichuris trichiura, es parásito de la mucosa del colon humano en la cual produce inflamación. La tricuriasis es probablemente la segunda infección parásita humana más común en las regiones tropicales. No obstante, sería un error considerar a T. trichiura como un parásito exclusivamente tropical, y así, aunque la infección es, hoy en día, más prevalente en regiones tropicales cálidas y húmedas, también se produce en zonas diferentes a los trópicos.

Unidos a estos datos de tipo epidemiológico, tenemos el hecho de que la infección zoonótica en Trichuris parece posible, y así lo demuestran las citas de infección humana con el tricúrido del perro (7. vulpis) (Burrows y Lillis, 1960; Harper y col., 1964; Kenney y Yermakov, 1980; Mirdha y col., 1998; Dunn y col., 2002) o infecciones mixtas con ambas especies (Vázquez y col., 1997). Sin embargo, parece mucho más probable la infección zoonótica con el tricúrido del cerdo (7. suis), ya que infecciones accidentales y en voluntarios humanos que han sido infectados con 7. suis indican que esta última especie es capaz de producir huevos totalmente viables durante algunos meses (Beer, 1976). Así, en muchas localidades donde los cerdos viven en las cercanías de los humanos es muy probable que se produzca la infección zoonótica. La diferenciación específica de los huevos de Trichuris trichiura, 7. suis y especies afines está basada en el tamaño del huevo. Sin embargo, Yoshikawa y col. (1989) mencionaron la presencia de huevos de Trichuris trichiura con dos tamaños diferentes obtenidos a partir del útero de los gusanos adultos. Por otra parte, cabe destacar que algunos antihelmínticos tienen un efecto sobre el sistema reproductivo de las hembras de 7. trichiura, favoreciendo así la producción de

huevos anormales, lo que podría conducir a un mal diagnóstico de la infección, ya que pueden confundirse con los huevos de otros parásitos o artefactos (Ferrer-Rodríguez y Kozek, 2007). De esta forma, hasta el momento, no existe ninguna característica o técnica que diferencie los huevos de las distintas especies de Tríchuris, salvo el hecho de encontrarse o aislarse de un hospedador determinado.

Por otra parte, las especies del género Tríchuris están entre las más comúnmente detectadas en las aguas residuales españolas. Los huevos del parásito causante de la tricuriasis humana, Tríchuris tríchiura son morfológicamente casi idénticos a los de Tríchuris suis y están considerados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como uno de los tres bioindicadores preferidos para valorar la calidad de un agua regenerada. De ahí la importancia que adquiere una buena y fiable determinación específica.

Actualmente, las especies del género Tríchuris han sido citadas como helmintos con unas características idóneas para ser utilizadas en la terapia de enfermedades autoinmunes, tales como la enfermedad de Crohn, la esclerosis múltiple y la diabetes tipo I (Elliott y col., 2007). Estas enfermedades resultan de la destrucción de tejidos debido a un proceso inflamatorio, y son prevalentes en países industrializados, muy desarrollados, siendo escasas en países poco desarrollados. Este hecho parece estar en relación con la exposición humana a los helmintos en países poco desarrollados y a la escasa o total ausencia de éstos en los países más desarrollados. Los helmintos disminuyen la respuesta inmune en humanos que están parasitados de forma natural y reduce la inflamación en la colitis experimental. Así, la exposición a los helmintos puede ayudar a prevenir o incluso a paliar la enfermedad de Crohn. En este sentido, se han llevado a cabo algunos ensayos por diversos autores (Sumners y col., 2005, Kradin y col., 2006) valorando la eficacia y seguridad del tratamiento de la enfermedad de Crohn con el helminto intestinal Tríchuris suis. Los resultados obtenidos apuntan a que esta nueva terapia puede ofrecer una alternativa segura, eficaz y única en la enfermedad de Crohn. Estos mismos resultados también soportan la premisa de que la exposición natural a los helmintos tales como Tríchuris suis proporciona protección a las enfermedades inmunológicas como la enfermedad de Crohn.

Las especies de Tríchuris tienen muchas características que las hacen buenas candidatas para su uso clínico. En concreto, T. suis tiene características adicionales que lo hacen un

candidato atractivo: puede obtenerse en grandes cantidades con absoluta pureza de cerdos criados en un ambiente específico libre de patógenos y no causa enfermedad humana, y, por lo tanto, disminuye el riesgo de su uso.

Actualmente existen varias técnicas de examen para detectar la presencia de huevos de parásitos en muestras fecales, incluyendo el examen fecal directo, la técnica de la concentración del formol-éter (Ridley y Hawgood, 1956; Alien y Ridley, 1970), la técnica de Kato-Katz (Katz y col., 1972; Peters y col., 1980), la técnica de McMaster (Who, 2008), y la técnica recientemente descrita de FLOTAC® (Cringoli, 2006). Entre ellas, la técnica de Kato-Katz (Peters y col., 1980) es la más comúnmente utilizada (Knopp, 2008; Goodman y col., 2007; Utzinger y col., 2008), debido a la facilidad de su uso en el campo y al costo relativamente bajo. La técnica de Kato-Katz es recomendada por la Organización Mundial de la Salud (WHO) para la vigilancia y las encuestas epidemiológicas de las geohelmintiasis (Who, 1994; Montresor y col., 1998). Diversos autores han citado que la presencia de huevos en muestras diarias fecales varía (Hall, 1982; Anderson y Schad, 1985; Marti y Koella, 1993; Booth y col., 2003) y, por lo tanto, la sensibilidad de la técnica de diagnóstico usada para determinar la tricuriasis queda limitada al día de toma de muestras para el diagnóstico de la infección. Así, varios autores (Utzinger y col., 2008, Booth y col., 2003) recomendaron el análisis de muestras fecales durante días... [Seguir leyendo]

1.- Método de diagnóstico in vitro de Tricuriasis humana y otras de origen animal basado en el uso de enzimas de restricción como marcadores moleculares caracterizado por comprender las siguientes etapas:

a) Aislamiento de huevos de Tríchurisde heces humanas, aguas residuales.

b) Cultivo a 32°C de estos huevos (opcional en función de la carga parasitaria).

c) Extracción de ADN de los huevos y amplificación mediante la técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) del gen citocromo oxidasa 1.

d) Purificación y digestión del producto PCR con enzimas específicas.

2.- Método de diagnóstico in vitro de Tricuriasis humana y otras de origen animal según reivindicación primera donde las enzimas de restricción utilizadas son (endonucleasas) Hae III, Mfe I y Pvu II que cortan específicamente para Tríchuris trichiura parásito del hombre pero no cortan en T. suis ni en T. vulpis.

3.- Método de diagnóstico in vitro de Tricuriasis humana y otras de origen animal según reivindicación primera donde las enzimas de restricción utilizadas son Avr II y Eco R I que cortan específicamente en T. vulpis parásito del perro y responsable de zoonosis en el hombre, pero no en T. suis ni en T. trichiura.

4.- Método de diagnóstico in vitro de Tricuriasis humana y otras de origen animal según reivindicación primera donde las enzimas de restricción utilizadas son Ava I, Taq I, Xho I que cortan específicamente en Trichurís suis parásito del cerdo y especie zoonótica para el hombre, pero no cortan en T. vulpis ni en T. trichiura parásito del hombre.

5.- Método de diagnóstico in vitro de Tricuriasis humana y otras de origen animal según reivindicación primera donde la enzima de restricción utilizada es la Mse I que diferencia

específicamente Trichuris suis, T. vulpis, T. trichiura, T. arvicolae, T. muris, T. ovis, T. discolor y T. skrjabini.

6.- Método de diagnóstico in vitro de Tricuriasis humana y otras de origen animal según

reivindicación primera donde la enzima de restricción utilizada es la Dra I que corta

específicamente para Trichuris trichiura parásito del hombre y T. suis pero no en T. vulpis.

7.- Enzimas de restricción como marcadores moleculares para el diagnóstico de la Tricuriasis según reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5 y 6 caracterizadas por las secuencias de la

citocromo oxidasa 1 de las que se han extraído las endonucleasas específicas, y que

comprende las secuencias SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9 y SEQ ID N° 10.

8.- Uso del método de diagnóstico in vitro de Tricuriasis humana y otras de origen animal

según reivindicación primera para amplificar y secuenciar el gen de la citocromo oxidasa 1

del ADN mitocondrial.

9.- Uso de enzimas de restricción como marcadores moleculares para el diagnóstico de la Tricuriasis humana y otras Tricuriasis de origen animal, según reivindicaciones 1, 2, 3, 4,

5, 6, 7 y 8, caracterizado por sus cebadores diseñados para amplificar el gen de la

citocromo oxidasa 1 en todas las especies del género Trichuris; HC02198F como cebador directo y CORA como reverso, y que comprenden las secuencias SEQ ID N° 11 y SEQ ID N° 12, respectivamente.