Sistemas de policétido sintasa de AGPI quiméricos y usos de los mismos.

Sistema de policétido sintasa (PKS) de ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) quimérico,

en el que un dominio deshidrasa-2 (DH2) de la proteína transportadora de b-hidroxiacil-acilo similar a FabA de un primer sistema de PKS de AGPI se sustituye por un dominio DH2 de un segundo sistema de PKS de AGPI diferente, para producir un sistema de PKS de AGPI quimérico que produce una razón diferente de AGPI omega-3 con respecto a omega-6 en comparación con el primer sistema de PKS de AGPI

Sistemas de policétido sintasa de AGPI quiméricos y usos de los mismos

Campo de la invención Esta invención se refiere a sistemas de policétido sintasa (PKS) de ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) quiméricos, y particularmente, a sistemas de PKS de AGPI quiméricos de Schizochytrium y Thraustochytrium. Más particularmente, se describen en el presente documento ácidos nucleicos que codifican para tales sistemas de PKS de AGPI, estos sistemas de PKS de AGPI, organismos modificados genéticamente que comprenden tales sistemas de PKS de AGPI, y métodos de preparación y uso de tales sistemas de PKS de AGPI.

Antecedentes de la invención Los sistemas de policétido sintasa (PKS) se conocen generalmente en la técnica como complejos enzimáticos relacionados con los sistemas de ácido graso sintasa (FAS) , pero que a menudo se modifican enormemente para producir productos especializados que muestran normalmente poca semejanza con los ácidos grasos. Sin embargo, se ha mostrado ahora que los sistemas similares a PKS, también denominados en el presente documento de manera intercambiable sistemas de PKS de AGPI, sistemas de AGPI sintasa o sistemas de PKS para la producción de AGPI, existen en bacterias marinas y determinados organismos eucariotas que pueden sintetizar ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) a partir de acetil-CoA y malonil-CoA. Las rutas de PKS de AGPI para la síntesis de AGPI en Shewanella y otras bacterias marinas, Vibrio marinus, se describen en detalle en la patente estadounidense n.º

6.140.486. Las rutas de PKS de AGPI para la síntesis de AGPI en el traustoquitridio eucariota, Schizochytrium, se describe en detalle en la patente estadounidense n.º 6.566.583. Las rutas de PKS de AGPI para la síntesis de AGPI 25 en eucariotas tales como miembros de Thraustochytriales, incluyendo la descripción adicional de un sistema de PKS de AGPI en Schizochytrium y la identificación de un sistema de PKS de AGPI en Thraustochytrium, incluyendo detalles referentes a usos de estos sistemas, se describen en detalle en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 20020194641, publicada el 19 de diciembre de 2002, y la publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 20070089199, publicada el 19 de abril de 2007. La publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 20040235127, publicada el 25 de noviembre de 2004, da a conocer la descripción estructural detallada de un sistema de PKS de AGPI en Thraustochytrium, y detalle adicional referente a la producción de ácido eicosapentaenoico (C20:5, ω-3) (EPA) y otros AGPI usando tales sistemas. La publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 20050100995, publicada el 12 de mayo de 2005, da a conocer la descripción estructural y funcional de sistemas de PKS de AGPI en Shewanella olleyana y Shewanella japonica, y usos de tales sistemas.

Estas solicitudes también dan a conocer la modificación genética de organismos, incluyendo microorganismos y plantas, con los genes que comprenden la ruta de PKS de AGPI y la producción de AGPI por tales organismos. Además, la publicación de patente PCT n.º WO 05/097982 describe un sistema de PKS de AGPI en Ulkenia, y la publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 20050014231 describe genes y proteínas PKS de AGPI de Thraustochytrium aureum.

Se describen sistemas de PKS de AGPI adicionales y usos de los mismos en los documentos WO 02/083870, WO 2004/087879, WO 2006/044646 y WO 2006/135866..

Los investigadores han intentado aprovechar los sistemas de policétido sintasa (PKS) que se han descrito 45 tradicionalmente en la bibliografía que se encuentran en uno de tres tipos básicos, denominados normalmente: tipo I (modular o iterativo) , tipo II y tipo III. Con fines de mayor claridad, se observa que el sistema de PKS de tipo I modular anteriormente también se ha denominado simplemente sistema de PKS “modular”, y el sistema de PKS de tipo I iterativo anteriormente también se ha denominado simplemente sistema de PKS “tipo I”. El sistema de tipo II se caracteriza por proteínas separables, cada una de las cuales lleva a cabo una reacción enzimática distinta. Las enzimas actúan conjuntamente para producir el producto final y cada enzima individual del sistema participa normalmente varias veces en la producción del producto final. Este tipo de sistema funciona de manera análoga a los sistemas de ácido graso sintasa (FAS) hallados en plantas y bacterias. Los sistemas de PKS de tipo I iterativo son similares al sistema tipo II en que las enzimas se usan de modo iterativo para producir el producto final. El tipo I iterativo difiere del tipo II en que las actividades enzimáticas, en vez de asociarse con proteínas separables, se 55 producen como dominios de proteínas más grandes. Este sistema es análogo a los sistemas de FAS de tipo I hallados en animales y hongos.

A diferencia de los sistemas tipo II, en los sistemas de PKS de tipo I modular, cada dominio enzimático se usa sólo una vez en la producción del producto final. Los dominios se encuentran en proteínas muy grandes y el producto de cada reacción se pasa a otro dominio en la proteína PKS. Adicionalmente, en los sistemas de PKS descritos anteriormente, si se incorpora un doble enlace carbono-carbono en el producto final, está habitualmente en la configuración trans.

Se han descubierto más recientemente sistemas de tipo III y pertenecen a la familia de enzimas de condensación de 65 la chalcona sintasa de plantas. Los PKS de tipo III son distintos de los sistemas de PKS de tipo I y tipo II y utilizan sustratos de acil-CoA libre en reacciones de condensación iterativas para producir habitualmente un producto final

heterocíclico.

Se considera que los ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) son útiles para fines nutricionales, farmacéuticos, industriales, y otros. El suministro actual de AGPI a partir de fuentes naturales y a partir de síntesis química no es 5 suficiente para las necesidades comerciales. Una fuente actual importante para AGPI es a partir de peces marinos; sin embargo, las reservas pesqueras están disminuyendo, y esto puede no ser un recurso sostenible. Adicionalmente, la contaminación, tanto por metales pesados como por moléculas orgánicas tóxicas, es un grave problema del aceite derivado de peces marinos. Los aceites vegetales derivados de cultivos de semillas oleaginosas son relativamente baratos y no tienen los problemas de contaminación asociados con los aceites de pescado. Sin embargo, los AGPI hallados en aceites de plantas desarrolladas comercialmente se limitan normalmente a ácido linoleico (dieciocho carbonos con 2 dobles enlaces, en las posiciones delta 9 y 12 - 18: 2 delta 9, 12) y ácido linolénico (18:3 delta 9, 12, 15) . En la ruta convencional (es decir, la ruta “habitual” o ruta “clásica”) para la síntesis de AGPI, ácidos grasos saturados de longitud de cadena media (productos de un sistema de ácido graso sintasa (FAS) ) se modifican mediante una serie de reacciones de elongación y desaturación. Los sustratos para la reacción de elongación son acil-CoA graso (la cadena de ácido graso que va a elongarse) y malonil-CoA (la fuente de los 2 carbonos añadidos durante cada reacción de elongación) . El producto de la reacción con elongasa es un acil-CoA graso que tiene dos carbonos adicionales en la cadena lineal. Las desaturasas crean dobles enlaces cis en la cadena de ácido graso preexistente mediante la extracción de 2 hidrógenos en una reacción dependiente de oxígeno. Los sustratos para las desaturasas son o bien acil-CoA (en algunos animales) o bien el ácido graso que se esterifica para dar la estructura principal de glicerol de un fosfolípido (por ejemplo, fosfatidilcolina) .

Por tanto, debido a que se requieren varias enzimas desaturasas y elongasas para la síntesis de ácidos grasos a partir de ácidos linoleico y linolénico para producir AGPI más insaturados y de cadena más larga, células huésped de plantas modificadas mediante ingeniería genética para la expresión de AGPI tales como EPA y ácido docosahexaenoico (DHA) pueden requerir la expresión de varias enzimas independientes para lograr la síntesis. Adicionalmente, para la producción de cantidades utilizables de tales AGPI, pueden requerirse esfuerzos de modificación mediante ingeniería genética adicionales. Por tanto, resulta de interés obtener material genético implicado en la biosíntesis de AGPI a partir de especies que producen de manera natural estos ácidos grasos (por ejemplo, a partir de un sistema de PKS de AGPI) y expresar el material aislado solo o en combinación en un sistema heterólogo que puede manipularse para permitir la producción de cantidades comerciales de AGPI.

Ha habido muchos esfuerzos... [Seguir leyendo]

1. Sistema de policétido sintasa (PKS) de ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) quimérico, en el que un dominio deshidrasa-2 (DH2) de la proteína transportadora de β-hidroxiacil-acilo similar a FabA de un primer sistema de PKS de AGPI se sustituye por un dominio DH2 de un segundo sistema de PKS de AGPI diferente, para producir un sistema de PKS de AGPI quimérico que produce una razón diferente de AGPI omega-3 con respecto a omega-6 en comparación con el primer sistema de PKS de AGPI.

2. Sistema de PKS de AGPI quimérico según la reivindicación 1, en el que una proteína que comprende el dominio DH2 del primer sistema de PKS de AGPI se sustituye por una proteína homóloga que comprende el dominio DH2 del segundo sistema de PKS de AGPI.

3. Sistema de PKS de AGPI quimérico según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el dominio DH2 del sistema de PKS de AGPI primero o segundo comprende un dominio DH2 de Schizochytrium o Thraustochytrium.

4. Sistema de PKS de AGPI quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que:

(a) el primer sistema de PKS de AGPI es un sistema de PKS de AGPI de Schizochytrium, y el segundo sistema de PKS de AGPI es un sistema de PKS de AGPI de Thraustochytrium,

(b) el primer sistema de PKS de AGPI es un sistema de PKS de AGPI de Schizochytrium, y el segundo sistema de PKS de AGPI es de un traustoquitridio diferente, en el que un OrfC que comprende un dominio DH2 del sistema de PKS de AGPI de Schizochytrium se sustituye por un OrfC que comprende un dominio DH2 del traustoquitridio diferente,

(c) el primer sistema de PKS de AGPI es un sistema de PKS de AGPI de Schizochytrium, y el segundo sistema de PKS de AGPI es de Thraustochytrium 23B, en el que un OrfC que comprende un dominio DH2 del sistema de PKS de AGPI de Schizochytrium se sustituye por un OrfC que comprende un dominio DH2 de Thraustochytrium 23B, o

(d) el primer sistema de PKS de AGPI es un sistema de PKS de AGPI de Schizochytrium, y el segundo sistema de PKS de AGPI es de Thraustochytrium 23B, en el que el dominio DH2 del OrfC del sistema de PKS de AGPI de Schizochytrium se sustituye por el dominio DH2 de Thraustochytrium 23B para producir una proteína quimérica que comprende el dominio DH2 de Thraustochytrium 23B.

5. Sistema de PKS de AGPI quimérico según la reivindicación 4, en el que el OrfC de Thraustochytrium 23B se codifica por una secuencia de ácido nucleico que está optimizada para el uso de codones de Schizochytrium.

6. Sistema de PKS de AGPI quimérico según la reivindicación 5, en el que la secuencia de ácido nucleico comprende SEQ ID NO: 70.

7. Sistema de PKS de AGPI quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en el que el OrfA del sistema de PKS de AGPI de Schizochytrium se sustituye por el OrfA de Thraustochytrium 23B.

8. Sistema de PKS de AGPI quimérico según la reivindicación 7, en el que el OrfA de Thraustochytrium 23B se codifica por una secuencia de ácido nucleico que está optimizada para el uso de codones de Schizochytrium.

9. Sistema de PKS de AGPI quimérico según la reivindicación 8, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica para OrfA comprende SEQ ID NO: 71.

10. Sistema de PKS de AGPI quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en el que el OrfB del sistema de PKS de AGPI de Schizochytrium se sustituye por el OrfB de Thraustochytrium 23B.

11. Sistema de PKS de AGPI quimérico según la reivindicación 10, en el que el OrfB de Thraustochytrium 23B se codifica por una secuencia de ácido nucleico que está optimizada para el uso de codones de Schizochytrium.

12. Sistema de PKS de AGPI quimérico según la reivindicación 11, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica para OrfB comprende SEQ ID NO: 72.

13. Sistema de PKS de AGPI quimérico según la reivindicación 4, en el que la proteína quimérica que comprende el dominio DH2 de Thraustochytrium 23B se codifica por una secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO:

73.

14. Sistema de PKS de AGPI quimérico según la reivindicación 4, en el que el DH2 de Thraustochytrium 23B se codifica por una secuencia de ácido nucleico que está optimizada para el uso de codones de Schizochytrium.

15. Sistema de PKS de AGPI quimérico según la reivindicación 4 o la reivindicación 14, en el que la proteína

quimérica que comprende el dominio DH2 de Thraustochytrium 23B se codifica por una secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 75.

16. Sistema de PKS de AGPI quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 ó 7-15, en el que el sistema de PKS de AGPI quimérico comprende una proteína que comprende: una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% a SEQ ID NO: 74, o una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74.

17. Sistema de PKS de AGPI quimérico según la reivindicación 1, en el que el sistema de PKS de AGPI quimérico:

(a) comprende SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 74,

(b) comprende SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 62,

(c) comprende SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 74,

(d) se codifica por moléculas de ácido nucleico que comprenden SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 70,

(e) se codifica por moléculas de ácido nucleico que comprenden SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 73,

(f) se codifica por moléculas de ácido nucleico que comprenden SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 75, o

(g) se codifica por moléculas de ácido nucleico que comprenden SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 70.

18. Método de alteración de la razón de omega-3 con respecto a omega-6 de AGPI producidos por un primer sistema de PKS de AGPI, que comprende expresar el sistema de PKS de AGPI quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1-17 en un organismo.

19. Método según la reivindicación 18, en el que el sistema de PKS de AGPI quimérico se expresa por un microorganismo o una planta.

20. Microorganismo o planta o parte de la planta modificado genéticamente, que comprende un sistema de PKS de AGPI quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1-17.

21. Método de aumento de la producción de AGPI y de alteración de la razón de omega-3 con respecto a omega-6 de AGPI producidos por un primer sistema de PKS de AGPI, que comprende expresar un sistema de PKS de AGPI quimérico en un organismo, en el que el dominio DH2 de un primer sistema de PKS de AGPI se sustituye por un dominio DH2 de un segundo sistema de PKS de AGPI diferente, para producir un sistema de PKS de AGPI quimérico que produce una razón diferente de AGPI omega-3 con respecto a omega-6 en comparación con el primer sistema de PKS de AGPI, y en el que el dominio DH2 del segundo sistema de PKS de AGPI está optimizado para el uso de codones del organismo del que se deriva el primer sistema de PKS de AGPI.