Propiedades antitumorales de inhibidores de proteasa modificados con NO.

Ésteres nítricos de los inhibidores de la proteasa del VIH en los que los inhibidores de la proteasa del VIH son seleccionados de saquinavir, ritonavir, nelfinavir.

Propiedades antitumorales de inhibidores de proteasa modificados con NO

La presente invención se refiere al éster nítrico de los inhibidores de la proteasa del VIH, en particular de Saquinavir, y a su uso en terapia humana Antecedentes de la invención Los inhibidores de la proteasa del VIH (IP-VIH) son agentes antirretrovirales aprobados para uso en seres humanos desde 1993. Los IP-VIH están diseñados para unirse al sitio catalítico de la proteasa del VIH de forma selectiva y, por lo tanto, bloquear la replicación y la producción de partículas virales infecciosas (Deeks et al 1997) . Se ha demostrado que estos fármacos afectaban a varios procesos celulares importantes, tales como la angiogénesis, inflamación, procesamiento y presentación de antígenos, la supervivencia celular y la remodelación de tejidos (Sgadari et al. 2003, Andre et al. 1998, Gruber et al. 2001, Delmonte et al. 2007) . Pruebas recientes indicaron una fuerte capacidad anticancerosa de los IP-VIH tanto in vitro como in vivo. La inhibición del crecimiento de diferentes células tumorales se acompañó de la inducción de la muerte celular apoptótica (Chow et al. 2006, Pajonk et al. 2002, Ikezoe et al. 2004, Ikezoe et al. 2000, Gills et al. 2007) . A pesar de que los mecanismos de acción de estos fármacos no están estrictamente definidas, sus objetivos potenciales son: AKT, la señal extracelular de quinasa regulada, factor-kB nuclear, transductores y activadores de la transcripción 3, metaloproteinasas de la matriz, el factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGF) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Pajonk et al. 2002, Ikezoe et al. 2004, Sgadari et al. 2002, Ikezoe et al. 2004, Gupta et al. 2005, Cuneo et al. 2007) . Por otra parte, se ha demostrado que estos fármacos sensibilizan a las células tumorales a la radiación, mejoran los efectos anticancerosos de otros fármacos citostáticos y, también, inhiben el crecimiento y la invasión de las células tumorales angiogénicas en ratones atímicos (Ikezoe et al., 2004, Sgadari et al. 2002, Gupta et al. 2005) .

Desafortunadamente, a la aplicación de estos fármacos le siguieron muchos efectos imprevistos y adversos tales como hiper o hipolipidemia, enfermedades cardiovasculares, diabetes, redistribución de la grasa corporal, osteopenia y osteoporosis (Flexner, 1998) . La adición del resto de NO es uno de los enfoques actuales empleados con el fin de reducir la toxicidad y mejorar la eficacia del fármaco. Este tipo de modificación química se aplicó sobre numerosos medicamentos antiinflamatorios no esteroideos.

Descripción de la invención En la actualidad se ha encontrado que los inhibidores de la proteasa del VIH, particularmente saquinavir, pueden modificarse ventajosamente mediante unión covalente de NO.

En consecuencia, la invención proporciona ésteres nítricos de los inhibidores de la proteasa del VIH.

El resto de NO se introduce en el grupo hidroxi presente en los inhibidores de la proteasa conocidos mediante procedimientos convencionales, es decir, mediante la reacción con ácido nítrico concentrado en anhídrido acético / hidrocarburo halogenado a temperaturas inferiores a 0 º C, preferentemente inferiores a -10 º C

Los inhibidores de la proteasa que, además de Saquinavir, están esterificados ventajosamente con ácido nítrico, incluyen ritonavir y nelfinavir.

El éster nítrico de Saquinavir es particularmente preferido, teniendo la fórmula I

** (Ver fórmula) **

Saquinavir-NO

así como sus sales no tóxicas, solvatos o formas polimórficas cristalinas. 5

Se descubrió que el compuesto de fórmula I, en lo sucesivo en el presente documento denominado NO-saquinavir, era más eficaz y menos tóxico que el compuesto saquinavir de la patente, como se mostrará en la parte experimental que se expone a continuación.

El esquema de síntesis del compuesto I se indica en la Figura 1.

La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto de fórmula I u otro éster nítrico de los inhibidores de la proteasa del VIH como se define en la reivindicación 1, mezclado con vehículos/ excipientes adecuados. Las composiciones de la invención pueden administrarse por cualquier vía conocida, en particular por vía oral, parenteral, tópica, transdérmica, rectal.

El experto en la materia determinará fácilmente la dosis de acuerdo con las propiedades toxicológicas, farmacocinéticas y farmacodinámicas, así como de acuerdo con las condiciones de los pacientes (gravedad de la enfermedad y el grado de avance) , el peso, la edad y el sexo. .Las dosificaciones serán en general similares a lo ya conocido en la práctica clínica para el compuesto saquinavir parental o para los correspondientes inhibidores de la proteasa parental.

Dichas composiciones son útiles para el tratamiento de tumores y de infecciones por VIH.

En consecuencia, la invención proporciona también tratamiento de pacientes afectados por tumores y / o infecciones de VIH que comprenden la administración a dichos pacientes de una cantidad eficaz del compuesto de la reivindicación 1.

Los ejemplos siguientes describen la invención con detalle.

Ejemplo 1 Síntesis de Saquinavir-NO

A una mezcla en agitación de ácido nítrico fumante (⥠90% HNO3, 1 ml, 23, 6 mmol) y Ac2O (3, 5 ml, 37, 1 mmol) a -10 º C se añadió saquinavir (3 g, 4, 48 mmol) en CHCl3 (18 ml) y después se calentó lentamente hasta la temperatura ambiente en dos horas en nitrógeno. La mezcla de reacción se inactivó con agua enfriada con hielo y se extrajo con CH2Cl2. Los extractos se lavaron con NaHCO3 saturado enfriada con hielo y agua, se secaron con MgSO4 y se filtraron. El disolvente se evaporó a presión y el producto bruto se purificó mediante FCC eluyendo con 3: 2 a 3: 3 Hex: Acetona. El producto obtenido se recristalizó en EtOAc / Hex para dar el Saquinavir-ONO2 (1, 7 g, 53%) como un sólido blanco y la pureza se analizó mediante HPLC y EM-EM m/z 716, 33 (M + H+) .

HPLC: Tipo de columna: Phenomenex Primesphere 5 C18 MC 110A 250 x 4, 6 mm

Longitud de onda de detección: 275 nm (longitud de onda máxima de absorbancia) .

Caudal: 1 ml / min con un gradiente lineal de agua (0, 1% AcOH) :

MeOH [90:10] en agua (0, 1 % AcOH) : MeOH [10:90] en 30 min Ejemplo 2 -Caracterización biológica Materiales y procedimientos Reactivos y células Naranja de acridina (AO) se obtuvo de Labo-Moderna (París, Francia) . El éster de diacetato succinimidil carboxifluoresceína (CFSE) era de Molecular Probes (Eugene, EE.UU.) . El inhibidor de Akt VI se obtuvo de Calbiochem (Alemania) . Todos los demás productos químicos se adquirieron en Sigma (St. Louis, EE.UU.) a menos que se especifique lo contrario. Saquinavir (SAQ, PM 670 g / l) y Saquinavir-NO (SAQ-NO, PM 715 g / l) se almacenaron a -20 º C a una concentración de 5 mg / ml en 25% de dimetilsulfóxido (DMSO) en RPMI 1640 -5% de FCS, y se diluyeron en medio de cultivo inmediatamente antes de su uso. Los cultivos de células de control se trataron con un volumen adecuado de DMSO.

Las líneas celulares de glioma C6 de rata y de glioblastoma U251 humano fueron un regalo del doctor Pedro Tranque (Universidad de Castilla-La Mancha, Albacete, España) , el melanoma murino B16 y el adenocarcinoma humano HeLa fueron un regalo del doctor Sinisa Radulovic (Instituto de Oncología y Radiología de Serbia, Belgrado, Serbia) , mientras que el fibrosarcoma de ratón L929 se obtuvo de la Colección Europea de Cultivos Celulares Animales (Salisbur y , Reino Unido) . Las células HCC1419 de mama y PC-3 de próstata humano se adquirieron en LGC Promochem srl (Venecia, Italia) . Los fibroblastos de ratón primarios y los astrocitos de rata se prepararon como se ha descrito (Mijatovic et al., 2004) . Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 tamponado con HEPES suplementado con 5% de FCS, glutamina 2 mM, 0, 01% de piruvato de sodio, 5 x 10-5M 2-mercaptoetanol, y antibióticos (medio de cultivo) a 37 º C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. Después del procedimiento de tripsinización convencional, las células se sembraron a 1 x 104/ pocillo en placas de 96 pocillos a 2 x 105/ pocillo en placa de 6 pocillos o 3 x 104/ pocillo en un portaobjetos de cámara de 4 pocillos, se cultivaron durante la noche y se expusieron al fármaco. Ratones C57BL / 6 endogámicos de 2-3 meses de edad se obtuvieron de nuestras

instalaciones en el Biological Research "Sinisa Stankovic" y se mantuvieron en condiciones de laboratorio estándar (sin patógeno específico) con acceso libre a comida y agua. La manipulación de los animales y el protocolo del estudio estaban en conformidad con las directrices internacionales y autorizados... [Seguir leyendo]

1. Ésteres nítricos de los inhibidores de la proteasa del VIH en los que los inhibidores de la proteasa del VIH son seleccionados de saquinavir, ritonavir, nelfinavir.

2. Éster nítrico de Saquinavir acuerdo con la reivindicación 1, de fórmula I

** (Ver fórmula) **

Saquinavir-NO sus sales no tóxicas, solvatos, formas polimórficas y/o o cristalinas polimórfica.

3. Composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de las reivindicaciones 1-2, en mezcla con 10 portadores / excipientes adecuados.

4. Los compuestos de las reivindicaciones 1-2, para su uso en el tratamiento de tumores o infecciones por el VIH.

5. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, para su uso en el tratamiento de pacientes afectados por tumores y / o infecciones de VIH que comprende la administración a dichos pacientes de una cantidad eficaz de dichos compuestos