Procedimientos para el replegamiento de insulina.

Procedimiento para obtener un precursor de insulina, análogos de insulina o derivados de los mismos que tienen puentes de cistina unidos correctamente,

comprendiendo el procedimiento:

mezclar un precursor de insulina, análogos de insulina o derivados de los mismos que tienen puentes de cistina unidos incorrectamente con una disolución acuosa o un tampón que contiene tanto cisteína o clorhidrato de cisteína como uno o más de agentes auxiliares caotrópicos a un pH de 8 a 11,5 y a una temperatura de desde 2ºC hasta 55ºC; en el que la concentración de precursor es de más de 0,65 g/litro;

b. diluir de manera inversa añadiendo lentamente un diluyente a la mezcla de reacción de la etapa (a), a un pH de 8 a 11,5 y a una temperatura de 2ºC a 40ºC; y

c. aislar el precursor de insulina, análogos de insulina o derivados de los mismos que tienen puentes de cistina unidos correctamente

en el que dicho precursor de la insulina o un derivado de insulina del mismo tiene una secuencia según la fórmula I:

R2-R1-B2-R4-B4-B27-R5-R6-R7-X-Gly-A2-A20-R3, en la que

R2 es

a. un átomo de hidrógeno,

b. un residuo de aminoácido del grupo que consiste en lisina (Lys) y arginina (Arg), o

c. un péptido que tiene de 2 a 45 residuos de aminoácido, que comprende el residuo de aminoácido lisina (Lys) o arginina (Arg) en el extremo carboxilo del péptido;

R1 es un residuo de fenilalanina (Phe) o un enlace covalente;

R4 corresponde a la posición B-3 de la insulina humana y es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en asparagina, lisina y prolina;

R5-R6-R7 corresponde a la posición B-28, B-29 y B-30 de la cadena de la insulina humana, respectivamente;

R5 puede seleccionarse del grupo que consiste en asparagina, lisina, leucina, prolina, valina, ácido aspártico, ácido glutámico y alanina opcionalmente sustituidos con un grupo acilo que tiene al menos 10 átomos de carbono;

R6 puede seleccionarse del grupo que consiste en lisina, ácido glutámico y prolina opcionalmente sustituidos con un grupo acilo que tiene al menos 10 átomos de carbono;

R7 puede seleccionarse del grupo que consiste en treonina, des-treonina, alanina y serina; (B2 y B4-B27) son los residuos de aminoácido en las posiciones B2, B4 a B27 de la cadena B de la insulina humana o insulina animal.

Campo de la invención

La invención se refiere a procedimientos para obtener un precursor de insulina, análogos de insulina o derivados de los mismos que tiene puentes de cistina unidos correctamente. El procedimiento incluye solubilizar un precursor de proinsulina que tiene puentes de cistina unidos incorrectamente en una disolución acuosa o un tampón que contiene uno o ambos de cisteína o clorhidrato de cisteína y uno o más de agentes auxiliares caotrópicos. Entonces se repliegan los precursores solubilizados añadiendo un diluyente a la mezcla solubilizada (dilución inversa). Además, los precursores solubilizados, en los que la concentración de precursor es de más de ,65 g/litro, también pueden replegarse diluyendo la mezcla de reacción con un diluyente que contiene aproximadamente el 5-4% v/v de alcohol isopropílico.

Antecedentes de la invención

La insulina es una hormona proteica que consiste en una cadena A ácida de 21 residuos de aminoácido y una cadena B básica de 3 aminoácidos. La cadena A y la cadena B están unidas entre sí por seis residuos de cisteína que forman tres enlaces disulfuro entre las siguientes posiciones: A 6-A 11; A 7-B 7; A 2-B 19.

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Los tres enlaces disulfuro son importantes en el mantenimiento de la conformación nativa y las actividades biológicas de la molécula de insulina. La insulina se pliega para dar una estructura tridimensional única compuesta principalmente por tres segmentos de hélice a (A2-A8, A13-A19 y B9-B19) estabilizados por sus tres enlaces disulfuro.

Los análogos y derivados de insulina difieren de la insulina humana en una o más de una posición de aminoácido y/o longitud de cadena de aminoácidos.

La insulina, análogos y derivados de insulina se preparan usando tecnología de ADN recombinante en E. coli o levadura. Cuando se usa E. coli como célula huésped, la insulina expresada no estará en su conformación soluble y biológicamente activa, nativa. A diferencia de la proteína nativa, se acumulan cuerpos de inclusión inactivos en la célula huésped. Estos cuerpos de inclusión contienen proteína recombinante en una forma altamente enriquecida con plegamiento incorrecto. Como consecuencia, la proteína recombinante debe aislarse, replegarse en condiciones adecuadas y convertirse enzimáticamente en la insulina biológicamente activa.

Existen dos cuestiones importantes en la recuperación de proteínas activas a partir de cuerpos de inclusión.

Éstas incluyen:

(a) Solubilización de proinsulinas, y

(b) Replegamiento de proinsulinas.

Se usan comúnmente agentes caotrópicos y detergentes como agentes solubilizantes. Actúan como agentes desnaturalizantes de proteína. Los agentes caotrópicos rompen los puentes de hidrógeno en disolución, alterando así las interacciones intermoleculares e intramoleculares con desplegamiento parcial o completo de la estructura proteica.

Una clave para el procedimiento de solubilización es la adición de un agente reductor para mantener residuos de cisteína en el estado reducido y así impedir la formación de disulfuro intramolecular e intermolecular no nativo en disoluciones de proteína altamente concentradas a pH alcalino.

El replegamiento se logra mediante la eliminación de agentes desnaturalizantes en exceso mediante dilución, intercambio de tampón, diafiltraciones, cromatografía de filtración en gel o inmovilización sobre un soporte sólido. Debido a su simplicidad, habitualmente se prefiere la dilución para el replegamiento de proteínas a escala industrial.

La concentración de proteína presente en una mezcla de solubilización que contiene agente reductor y agente auxiliar caotrópico desempeña un papel importante en la decisión del rendimiento final de proinsulinas plegadas correctamente. Como la concentración de proteína en medios de solubilización que contienen tanto cisteína como agente auxiliar caotrópico está aumentada, la probabilidad de agregación o precipitación de proteínas aumenta debido al aumento de la interacción.

El otro factor que da como resultado la agregación de moléculas de proteína es el cambio repentino en la concentración de agente desnaturalizante, que fuerza a las moléculas de proteína a colapsarse para dar una estructura compacta que da como resultado precipitación o agregación.

Cuando se elimina el agente desnaturalizante durante el replegamiento, el efecto hidrófobo hace que la molécula de proteína no plegada secuestre sus grupos hidrófobos, conduciendo a agregación. Para la aplicación Industrial es deseable eliminar o minimizar la formación de agregados de proteína.

Las patentes estadounidenses n.°s 5.663.291; 5.473.49; 5.986.48; 6.38.355 y la solicitud de patente estadounidense 271663 dan a conocer procedimientos para obtener un precursor de Insulina o derivados de insulina del mismo que tienen puentes de cistina unidos correctamente. Además, el documento RU2141531 da a conocer un método de replegamiento del precursor de Insulina que implica la disolución de cuerpos de inclusión con urea/ditiotreitol presentes al mismo tiempo y la purificación posterior en alcohol isopropílico al 4%.

Winter, J. et al. Renaturation of human proinsulin-a study on refolding and conversión to ¡nsulln. Analytlcal biochemistry (22), 31 (2), 148-155 dan a conocer el replegamiento de proinsulina humana en condiciones redox adecuadas.

Sumario de la invención

En un aspecto general se proporciona un procedimiento para obtener un precursor de insulina, análogos de Insulina o derivados de los mismos que tienen puentes de cistina unidos correctamente, comprendiendo el procedimiento:

a. mezclar un precursor de insulina, análogos de Insulina o derivados de los mismos que tienen puentes de cistina unidos incorrectamente con una disolución acuosa o un tampón que contiene tanto cisteína o clorhidrato de cisteína como uno o más de agentes auxiliares caotrópicos, a un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 11,5 y a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 55°C, en el que la concentración de precursor es de más de ,65 g/litro;

b. diluir de manera inversa añadiendo lentamente un dlluyente a la mezcla de reacción de la etapa (a), a un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 11,5 y a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 4°C; y

c. aislar el precursor de insulina, análogos de Insulina y derivados de los mismos que tienen puentes de cistina unidos correctamente.

El término "análogo de insulina humana" (y expresiones similares) tal como se usa en el presente documento se refiere a insulina humana en la que uno o más aminoácidos se han delecionado y/o se han sustituido por otros aminoácidos, incluyendo aminoácidos no codificables, o insulina humana que comprende aminoácidos adicionales, es decir más de 51 aminoácidos.

El término "derivados de insulina humana" (y expresiones similares) tal como se usa en el presente documento se refiere a insulina humana o un análogo de la misma en la que al menos un sustltuyente orgánico está unido a uno o

más de los aminoácidos.

En otro aspecto general se proporciona un procedimiento para obtener un precursor de insulina, análogos de insulina o derivados de los mismos que tienen puentes de cistina unidos correctamente, comprendiendo el procedimiento:

a. mezclar un precursor de insulina, análogos de insulina o derivados de los mismos que tienen puentes de cistina unidos incorrectamente con una disolución acuosa o un tampón que comprende cisteína o clorhidrato de cisteína y uno o más de agentes auxiliares caotrópicos, a un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 11,5 y a una temperatura de aproximadamente 15°C a aproximadamente 55°C; en el que la concentración de precursor es de más de ,65 g/litro,

b. mezclar la mezcla de reacción de la etapa (a) con un diluyente que contiene el 5-4% (v/v) de alcohol isopropílico, a un pH de 8 a 11,5 y una temperatura de 2°C a 4°C; y

c. aislar el precursor de insulina, análogos de insulina y derivados de los mismos que tienen puentes de

cistina unidos correctamente.

Las realizaciones del procedimiento para obtener el precursor de Insulina, análogo de insulina o derivados de los mismos que tienen puentes de cistina unidos correctamente pueden incluir una o más de las siguientes características. El procedimiento puede incluir además tampones, disolventes, aditivos, agentes auxiliares caotrópicos, y similares.

Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en la descripción a continuación. Otras características, objetos y ventajas de la invención... [Seguir leyendo]

Procedimiento para obtener un precursor de insulina, análogos de insulina o derivados de los mismos que tienen puentes de cistina unidos correctamente, comprendiendo el procedimiento:

mezclar un precursor de insulina, análogos de insulina o derivados de los mismos que tienen puentes de cistina unidos incorrectamente con una disolución acuosa o un tampón que contiene tanto cisterna o clorhidrato de cisterna como uno o más de agentes auxiliares caotrópicos a un pH de 8a 11,5ya una temperatura de desde 2°C hasta 55°C; en el que la concentración de precursor es de más de ,65 g/litro;

b. diluir de manera inversa añadiendo lentamente un diluyente a la mezcla de reacción de la etapa (a), a un pH de 8 a 11,5 y a una temperatura de 2°C a 4°C; y

c. aislar el precursor de insulina, análogos de insulina o derivados de los mismos que tienen puentes de cistina unidos correctamente

en el que dicho precursor de la insulina o un derivado de insulina del mismo tiene una secuencia según la fórmula I:

R2-R1-B2-R4-B4-B27-R5-R6-R7-X-Gly-A2-A2-R3,

en la que

R2 es

a. un átomo de hidrógeno,

b. un residuo de aminoácido del grupo que consiste en lisina (Lys) y arginina

(Arg), o

c. un péptido que tiene de 2 a 45 residuos de aminoácido, que comprende el residuo de aminoácido lisina (Lys) o arginina (Arg) en el extremo carboxilo del péptido;

R1 es un residuo de fenilalanina (Phe) o un enlace covalente;

R4 corresponde a la posición B-3 de la insulina humana y es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en asparagina, lisina y prolina;

R5-R6-R7 corresponde a la posición B-28, B-29 y B-3 de la cadena de la insulina humana, respectivamente;

R5 puede seleccionarse del grupo que consiste en asparagina, lisina, leucina, prolina, valina, ácido aspártico, ácido glutámico y alanina opcionalmente sustituidos con un grupo acilo que tiene al menos 1 átomos de carbono;

R6 puede seleccionarse del grupo que consiste en lisina, ácido glutámico y prolina opcionalmente sustituidos con un grupo acilo que tiene al menos 1 átomos de carbono;

R7 puede seleccionarse del grupo que consiste en treonina, des-treonina, alanina y serina;

(B2 y B4-B27) son los residuos de aminoácido en las posiciones B2, B4 a B27 de la cadena B de la insulina humana o insulina animal;

X es

i. un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina (Lys) y arginina (Arg), o

ii. un péptido que tiene de 2 a 35 residuos de aminoácido, que comprende el residuo de aminoácido lisina (Lys) o arginina (Arg) en el extremo N-terminal y en el extremo carboxilo del péptido, o

iii. un péptido que tiene de 2 a 35 aminoácidos que pueden codificarse genéticamente, que comprende de 1 a 5 residuos de histidina;

2.

3.

4.

7.

8.

9.

(A2-A2) son los residuos de aminoácido en las posiciones A2 a A2 de la cadena A de la insulina humana o insulina animal; y

R3 es un residuo de aminoácido que puede codificarse genéticamente.

Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la concentración de cisteína o clorhidrato de cisteína en la etapa (a) varía desde 2 mM hasta 6 mM.

Procedimiento según la reivindicación 1, en el que uno o más de agentes auxiliares caotrópicos se seleccionan del grupo que consiste en sulfato de amonio, clorhidrato de guanidina, carbonato de etileno, tiocianato, dimetilsulfóxido y urea.

Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la concentración de agente auxiliar caotrópico varía desde 5 M hasta 1 M.

Procedimiento según la reivindicación 1, en el que eltampón en la etapa (a) puede seleccionarse del grupo que consiste en tampón glicina, tampón fosfato, tampón carbonato, tampón tris y tampón etanolamina.

Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el diluyente en la etapa (b) puede seleccionarse del grupo que consiste en agua, tampón glicina, tampón fosfato, tampón carbonato, tampón tris, tampón etanolamina, alcohol C1-C4 y disolución de cistina o clorhidrato de cistina.

Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la disolución acuosa o un tampón en la etapa (a) o diluyente en la etapa (b) puede comprender además uno o más aditivos seleccionados del grupo que consiste en ácido etilendiaminatetraacético, ácido etilenglicoltetraacético (EGTA), arginina, glicina, alanina, azúcares, polioles, sales tales como sulfato de amonio y cloruro de magnesio, y ciclodextrinas o sales de las mismas.

Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa (a) o la etapa (b) se lleva a cabo a una temperatura de desde 2°C hasta 25°C.

Procedimiento para obtener un precursor de insulina, análogo de insulina o derivados de los mismos que tienen puentes de cistina unidos correctamente, comprendiendo el procedimiento:

a. mezclar un precursor de insulina, análogo de insulina o derivados de los mismos que tienen puentes de cistina unidos incorrectamente con una disolución acuosa o un tampón que comprende tanto cisteína o clorhidrato de cisteína como uno o más de agentes auxiliares caotrópicos a un pH de7a11,5ya una temperatura de 2°C a 55°C; en el que la concentración de precursor es de más de ,65 g/litro;

b. mezclar la mezcla de reacción de la etapa (a) con un diluyente que contiene 5-4% (v/v) de alcohol isopropílico a un pH de 8 a 11,5 y a una temperatura de 2°C a 4°C; y

c. aislar los precursores de insulina, análogos de insulina y derivados de los mismos que tienen puentes de cistina unidos correctamente

en el que dicho precursor de la insulina o un derivado de insulina del mismo tiene una secuencia según la fórmula I:

R2-R1-B2-R4-B4-B27-R5-R6-R7-X-Gly-A2-A2-R3,

en la que

R2 es

a. un átomo de hidrógeno,

b. un residuo de aminoácido del grupo que consiste en Usina (Lys) y arginina (Arg), o

c. un péptido que tiene de 2 a 45 residuos de aminoácido, que comprende el residuo de aminoácido lisina (Lys) o arginina (Arg) en el extremo carboxilo del péptido;

R1 es un residuo de fenilalanina (Phe) o un enlace covalente;

R4 corresponde a la posición B-3 de la insulina humana y es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en asparagina, lisina y prolina;

11.

12.

13. 45

14.

R5-R6-R7 corresponde a la posición B-28, B-29 y B-3 de cadena de la insulina humana, respectivamente;

R5 puede seleccionarse del grupo que consiste en asparagina, lisina, leucina, prolina, valina, ácido aspártico, ácido glutámico y alanina opcionalmente sustituidos con un grupo acilo que tiene al menos 1 átomos de carbono;

R6 puede seleccionarse del grupo que consiste en lisina, ácido glutámico y prolina opcionalmente sustituidos con un grupo acilo que tiene al menos 1 átomos de carbono;

R7 puede seleccionarse del grupo que consiste en treonina, des-treonina, alanina y serina;

(B2 y B4-B27) son los residuos de aminoácido en las posiciones B2, B4 a B27 de la cadena B de la insulina humana o insulina animal;

X es

i. un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina (Lys) y arginina (Arg), o

ii. un péptido que tiene de 2 a 35 residuos de aminoácido, que comprende el residuo de aminoácido lisina (Lys) o arginina (Arg) en el extremo N-terminal y en el extremo carboxilo del péptido, o

iii. un péptido que tiene de 2 a 35 aminoácidos que pueden codificarse genéticamente, que comprende de 1 a 5 residuos de histidina;

(A2-A2) son los residuos de aminoácido en las posiciones A2 a A2 de la cadena A de la insulina humana o insulina animal; y

R3 es un residuo de aminoácido que puede codificarse genéticamente.

Procedimiento según la reivindicación 9, en el que la concentración de cisterna o clorhidrato de cisterna en la etapa (a) varía desde 2 mM hasta 6 mM.

Procedimiento según la reivindicación 9, en el que uno o más de agentes auxiliares caotrópicos se seleccionan del grupo que consiste en sulfato de amonio, clorhidrato de guanidina, carbonato de etileno, tiocianato, dimetilsulfóxido y urea.

Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la concentración de agente auxiliar caotrópico varía desde 5 M hasta 1 M.

Procedimiento según la reivindicación 9, en el que el tampón en la etapa (a) puede seleccionarse del grupo que consiste en tampón glicina, tampón fosfato, tampón carbonato, tampón tris y tampón etanolamina.

Procedimiento según la reivindicación 9, en el que la disolución acuosa o un tampón en la etapa (a) y diluyente en la etapa (b) pueden comprender además uno o más de aditivos seleccionados del grupo que consiste en, ácido etilendiaminatetraacético, ácido etilenglicoltetraacético (EGTA), arginina, glicina, alanina, azúcares, sales tales como sulfato de amonio y cloruro de magnesio, y ciclodextrinas o sales de las mismas.

Procedimiento según la reivindicación 9, en el que la etapa (a) o la etapa (b) se lleva a cabo a una temperatura de desde 2°C hasta 25°C.