Plasmina modificada de forma recombinante.

Polinucleótido, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que es por lo menos 95% idéntico a la SEQ ID NO:

2, que tiene

a) un dominio kringle N-terminal único homólogo a un dominio kringle del plasminógeno humano nativo, en el que los cuatro últimos residuos de aminoácidos dentro del dominio kringle son V, P, Q y C; y

b) un sitio de activación del dominio C-terminal y un dominio de serina proteasa homólogos a los dominios correspondientes en el plasminógeno humano; en los que el polipéptido se une a lisina inmovilizada.

Plasmina modificada de forma recombinante Antecedentes de la invención

El plasminógeno humano es una proteína de cadena sencilla que contiene 791 residuos de aminoácido. La activación de plasminógeno a plasmina resulta de una escisión sencilla del enlace peptídico Arg561-Val562 en el zimógeno. La molécula de plasmina resultante es una serina proteasa enlazada con disulfuro, de dos cadenas con especificidad tipo tripsina (escisión después de Lys yArg).

La cadena pesada amino-terminal de plasmina (residuos 1-561, ~6 kDa) se compone de cinco dominios kringle, cada uno conteniendo aproximadamente 8 residuos de aminoácido. Los dominios kringle son responsables de las propiedades reguladoras de plasminógeno, tal como interacción con inhibidores de activación, por ejemplo, iones Cf1; con estimuladores de activación, por ejemplo, ácido s-aminocaproico con células mamíferas y bacterianas; y con otras proteínas, tales como el de sustrato fisiológico de plasmina, fibrina y el inhibidor de plasmina oc2-antiplasmina. De todos los cinco kringles, el kringle 1 es uno de los más multi-funcionales: su actividad de unión a lisina se ha mostrado que es responsable de interacción de plasmina con a2-anti-plasmina y fibrina. Véase, Wiman, B., y otros, Biochim. Biophys. Acta 579:142-154 (1979); y Lucas, M.A., y otros, J. Biol. Chem. 258:4249-4256 (1983).

La cadena ligera C-terminal de la plasmina (residuos 562-791, ~25kDa) es una serina proteasa típica, homologa a tripsina y que contiene la triada catalítica serina proteasa clásica: His63, Asp646 y Ser741. El plasminógeno contiene 24 puentes de hidrógeno y 2 sitios de glicosilación en Asn289 y Thr346.

La proteolisis limitada de plasminógeno por medio de la elastasa ha mostrado que resulta en tres fragmentos principales (Sottrup- Jensen, L., y otros, Prog. Chem. Fibrinol. Thrombol, 3:191-29 (1978)). El primer fragmento, K1-3, incluye los primeros tres kringles y se pueden aislar en dos versiones, Tyr8-Val338 y Tyr8-Val354. El segundo fragmento, K4, corresponde al cuarto kringle e incluye residuos Val355-Ala44. El último fragmento C-terminal (el denominado miniplasminógeno) incluye residuos Val443-Asn791 y consiste del quinto kringle y el dominio serina proteasa. El miniplasminógeno se puede activar de la misma manera que plasminógeno, formando miniplasminógeno.

Debido a la compleja estructura de la molécula del plasminógeno de longitud completa, los sistemas de expresión bacteriana no han demostrado su utilidad para la producción del plasminógeno recombinante. El plasminógeno se produce en la forma de cuerpos de inclusión insolubles y no es replegable de ese estado. Además, la expresión de plasminógeno en células de mamífero se complica por la activación intracelular de plasminógeno en plasmina y la citotoxicidad resultante. La producción de plasminógeno completamente activo utilizando células de insecto es posible, sin embargo, este sistema no es adecuado para la producción a gran escala debido al bajo rendimiento. Además, como con cualquier régimen de la proteína recombinante, existe la posibilidad de encontrarse con problemas de inmunogenicidad en el sujeto receptor de la proteína recombinante terapéutica.

La inmunogenicidad puede ser un obstáculo para la utilización efectiva y/o eficiente de determinados regímenes terapéuticos de proteína recombinante. La inmunogenicidad es una compleja serie de respuestas a una sustancia (por ejemplo, la estructura química de una proteína que incluye la secuencia de aminoácidos) que se percibe como extraño y puede incluir la producción de anticuerpos neutralizantes y no neutralizantes, la formación de complejos inmunes, la activación del complemento, la activación de mastocitos, inflamación y anafilaxis. La inmunogenicidad puede limitar la eficacia y seguridad de una proteína terapéutica en múltiples formas. La eficacia se puede reducir directamente por la formación de anticuerpos neutralizantes. La eficacia también se puede reducir indirectamente, como la unión a cualquiera de los anticuerpos neutralizantes o no neutralizantes por lo general conduce a la rápida eliminación del suero. Los efectos secundarios graves e incluso la muerte pueden ocurrir cuando una reacción inmune surge. Una clase especial de efectos secundarios se produce cuando los anticuerpos neutralizantes reaccionan de forma cruzada con una proteína endógena y bloquean su función.

En consecuencia, una proteína modificada recombinante, que posee las características deseables (por ejemplo, regiones con estructuras químicas tipo nativo) de plasmina/plasminógeno mientras que carece de ciertas características negativas y es capaz de la producción en sistemas de expresión de proteína recombinante incluyendo células bacterianas en cantidades considerables, es deseable.

La solicitud de patente PCT WO 27/47874 A dio a conocer delta-plasminógeno, un plasminógeno mutante por delección en el que se elimina la parte media de la molécula, aunque la molécula resultante es diferente a las de la presente invención.

La otra parte, Medynski D. y otros (Medynski, y otros "Replegamiento, purificación y activación de miniplasminógeno aislado de cuerpos de inclusión de E. coli" ("Refolding, purification, and activation of miniplasminogen and microplasminogen ¡solated from E. Coli inclusión bodies") Protein Expression and Purification, Academic Press, San Diego, CA, vol. 52, no. 2, 26 de octubre de 26, páginas 395-42) dan a conocer el replegamiento, purificación, y activación de plasminógeno aislado de cuerpos de inclusión de E. Coli.

Características de la invención

En un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene:

a) un dominio único kringle N-terminal homólogo a un dominio kringle del plasminógeno humano nativo, en el que los últimos cuatro residuos de aminoácidos en el dominio kringle son V, P, Q y C; y

b) un sitio de activación de dominio C-terminal y dominio de la serina proteasa homólogos a los dominios correspondientes en plasminógeno humano; en los que el polipéptido se une a la lisina inmovilizada y es capaz de activarse a enzimas de plasmina funcionales después de un suceso de activación que implica, como mínimio, la escisión proteolítica de un enlace peptídico Arg-Val localizado entre el dominio kringle y el dominio proteasa.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido codificado por el polinucleótido anterior.

En otro aspectos, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la presente invención. En una realización, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos tal como se muestra

en la SEQ ID NO: 1.

En algunos aspectos, la presente invención proporciona una célula cultivada que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. En una realización, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 1. En otra realización, la célula cultivada es un organismo procariótico. En una realización, el organismo procariótico es E. coli.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para la fabricación de uno o más polipéptidos recombinantes de plasmina que tienen extremos N-terminales diferentes. El método comprende:

a) proporcionar el polipéptido anterior

b) poner en contacto el polipéptido proporcionado en la etapa a) con una proteasa en condiciones suficientes para romper uno o más enlaces peptídicos para formar de esta manera el uno o más polipéptidos de plasmina recombinantes que tienen extremos N-terminales diferentes. En una realización, proporcionar comprende expresar un cuadro de lectura abierta con una secuencia correspondiente a la secuencia tal como se muestra en la SEQ ID NO: 1, o una variante degenerada de la misma, en un huésped adecuado. En otra realización, el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEQ ID NO: 2.

DESCRIPCION BREVE DE LOS DIBUJOS

La figura 1 es una representación esquemática de la plasmina nativa después de la activación por escisión proteolítica. K1-K5 son reglones kringle 1-5; y SP es el dominio de la serina proteasa. "o2-AP" es el sitio de unión a2-antiplasmina en el kringle 1.

La figura 2 es una representación esquemática de un muíante de supresión de plasminógeno de la presente invención utilizando la misma nomenclatura como en la figura 1, y mostrando la supresión del K2-5.

La figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de plasminógeno humano, mostrando la secuencia líder de 19-residuo numerada como -19... [Seguir leyendo]

1. Polinucleótido, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que es por lo menos 95% idéntico a la SEQ ID NO: 2, que tiene

a) un dominio kringle N-terminal único homólogo a un dominio kringle del plasminógeno humano nativo, en el que los cuatro últimos residuos de aminoácidos dentro del dominio kringle son V, P, Q y C; y

b) un sitio de activación del dominio C-terminal y un dominio de serina proteasa homólogos a los dominios correspondientes en el plasminógeno humano; en los que el polipéptido se une a Usina inmovilizada.

2. Polinucleótido, según la reivindicación 1, en el que el polipéptido codificado es la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2.

3. Polinucleótido, según la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una vahante degenerada de la misma.

4. Polinucleótido, según la reivindicación 1, en el que el polipéptido muestra una afinidad de unión más baja por el fibrinógeno que la afinidad de unión por el fibrinógeno de miniplasmina.

5. Polinucleótido, según la reivindicación 1, en el que el polipéptido muestra una afinidad de unión más alta por fibrina escindida parcialmente que la afinidad de unión por fibrina de miniplasmina escindida parcialmente.

6. Polinucleótido, según la reivindicación 1, en el que el polipéptido tiene inmunogenicidad reducida en comparación con un polipéptido de referencia, en el que el polipéptido de referencia tiene una secuencia de aminoácidos primaria idéntica a la secuencia de aminoácidos primaria del polipéptido con la condición de que los cuatro últimos residuos de aminoácidos del dominio kringle N-terminal único del polipéptido de referencia no sean V, P, Q, y C.

7. Polipéptido codificado por un polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Polipéptido, según la reivindicación 7, en el que el polipéptido muestra una actividad fibrinolítica que es inhibida por la a2-antiplasm¡na a una velocidad de inhibición que es por lo menos aproximadamente 5 veces más rápida que la velocidad de inhibición de la actividad fibrinolítica de miniplasmina por cfc-antiplasmina.

9. Polipéptido, según la reivindicación 7, en el que el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEQ ID NO: 2, y sustituciones conservadoras de la misma.

1. Polipéptido, según la reivindicación 7, caracterizado además porque el polipéptido tiene un residuo de arginina en una posición relativa análoga a la de la posición 85 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2.

11. Vector de expresión, que comprende el polinucleótido, según la reivindicación 1.

12. Célula cultivada, que comprende el vector de expresión, según la reivindicación 11.

13. Procedimiento para producir uno o más polipéptidos de plasmina recombinantes que tienen extremos N-terminales diferentes, comprendiendo el procedimiento:

a) proporcionan un polipéptido, según la reivindicación 7; y

b) poner en contacto el polipéptido proporcionado en la etapa a) con una proteasa en condiciones suficientes para escindir uno o más enlaces peptídicos para formar de esta manera uno o más polipéptidos de plasmina recombinantes que tienen extremos N-terminales diferentes.

14. Procedimiento, según la reivindicación 13, en el que el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEQ ID NO: 2.

15. Procedimiento, según la reivindicación 13, en el que proporcionar comprende expresar una secuencia de ADN mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una variante degenerada de la misma, en E. coli.