Procedimiento para la preparación del inhibidor de proteinasa alfa-1.

Procedimiento para purificar el inhibidor de proteinasa a-1 a partir de una solución acuosa que contiene inhibidor de proteinasa alfa-1,

que comprende las etapas de:

(a) eliminar una parte de proteínas contaminantes de la solución acuosa para obtener una solución purificada que contiene inhibidor de proteinasa alfa-1, en el que dicha etapa de eliminación comprende las etapas de:

(i) precipitar dicha parte de proteínas contaminantes de dicha solución acuosa mediante la adición de un polietilenglicol con un PM entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 4.000 a dicha solución acuosa a una concentración entre el 3% y el 15% en peso por volumen, y ajustar el pH de dicha solución acuosa de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0; y

(ii) separar dicha parte precipitada de proteínas contaminantes de dicha solución acuosa, obteniendo de este modo dicha solución purificada que contiene inhibidor de proteinasa alfa-1; a continuación

(b) diluir dicha solución purificada para reducir la conductividad de dicha solución purificada, de manera que el inhibidor de proteinasa alfa-1 se une a una resina de intercambio aniónico; a continuación

(c) pasar dicha solución purificada a través de una resina de intercambio aniónico, de manera que el inhibidor de proteinasa alfa-1 se une a dicha resina de intercambio aniónico; a continuación

(d) eluir el inhibidor de proteinasa alfa-1 de dicha resina de intercambio aniónico para obtener una solución eluida que contiene inhibidor de proteinasa alfa-1; a continuación

(e) ajustar el pH, la conductividad y la concentración de proteína de dicha solución eluida que contiene inhibidor de proteinasa alfa-1, de manera que el inhibidor de proteinasa alfa-1 no se une a una resina de intercambio catiónico;

(f) pasar la solución eluida a través de una resina de intercambio catiónico; y

(g) recoger el flujo que atraviesa dicha resina de intercambio catiónico que contiene inhibidor de proteinasa alfa-1.

Procedimiento para !a preparación del inhibidor de proteinasa alfa-1 Sector de la invención

La presente invención se refiere a la purificación del inhibidor de proteinasa alfa-1 (ot-1 Pl) a partir de soluciones acuosas. De manera más específica, la presente invención se refiere a la purificación de un ot-1 Pl a partir de plasma sanguíneo o de fracciones de plasma producidos a partir del fraccionamiento Cohn-Oncley con cromatografía. La eliminación viral se consigue mediante la adición de PEG y mediante nanofiltración. La inactivación de los virus envueltos se consigue mediante la adición de detergente antes del procedimiento de cromatografía.

Antecedentes

El inhibidor de proteinasa alfa-1 (ot-1 Pl) es una glicoproteína con un peso molecular de aproximadamente 55.000 Daltons. La proteína es una única cadena polipeptídica a la que varias unidades de oligosacáridos están unidas covalentemente. El alfa-1 Pl actúa como un inhibidor de proteasas endógenas, tales como la tripsina, quimotripsina, elastasa pancreática, colagenasa de la piel, renina, uroquinasa y proteasas de linfocitos polimorfonucleares.

El alfa-1 Pl se utiliza actualmente de forma terapéutica para tratar personas que tienen una deficiencia por causas genéticas de ot-1 Pl. En dicha afección, se administra a-1 Pl para inhibir la elastasa de linfocito en los pulmones. La elastasa de linfocitos se descompone en proteínas exógenas en los pulmones. Cuando el ot-1 Pl no está presente en cantidades suficientes para regular la actividad de elastasa, la elastasa descompone el tejido del pulmón. Con el tiempo, este desequilibrio da lugar a un daño crónico del tejido pulmonar y el enfisema. El ot-1 Pl se ha utilizado con éxito para tratar esta forma de enfisema.

La demanda de ot-1 Pl normalmente supera el suministro disponible. El alfa-1 Pl para su uso terapéutico se purifica actualmente a partir de plasma humano. Esta fuente de la proteína es limitada, lo cual contribuye a un suministro bajo. A efectos de maximizar el suministro disponible de a-1 Pl, un procedimiento para purificar a-1 Pl a partir de plasma humano debería tener el mayor rendimiento posible. La pureza del a-1 Pl aislado de plasma humano también es crítica porque trazas de impurezas pueden estimular las respuestas inmunes en pacientes que reciben a-1 Pl. Finalmente, el procedimiento de purificación de a-1 Pl a partir de plasma humano utilizando las técnicas actuales requiere una gran cantidad de tiempo para la separación del a-1 Pl de otras proteínas, virus, etc. Todos estos factores (es decir, rendimientos bajos, tiempos de producción largos y pureza baja), contribuyen al suministro inadecuado de a-1 Pl.

Se han descrito varios procedimientos de purificación de a-1 Pl a partir de plasma humano. Bollen y otros, patente de Estados Unidos No. 4.629.567 (1986) utilizaron cinco etapas diferentes de cromatografía para purificar el a-1 Pl a partir de levadura, E. co// y plasma humano. Las cinco etapas implicaban intercambio iónico DEAE, intercambio tiol-disulfuro, afinidad de heparina, cromatografía de quelato de zinc e intercambio iónico de amino hexilo. No se mostraron datos de pureza y rendimiento.

Novika y otros, Gematol. Transfuziol. 34: 46-50 (1989) dieron a conocer procedimientos de aislamiento de los subproductos de la fabricación de productos de la sangre. Utilizaron cromatografías de afinidad, celulosa DEAE y filtración en gel. Los datos de pureza y rendimiento no estaban disponibles.

Podiarene y otros, Vopr. Med. Khim. 35: 96-99 (1989) dieron a conocer un procedimiento de una única etapa para el aislamiento de a-1 Pl a partir de plasma humano utilizando cromatografía de afinidad con anticuerpos monoclonales. La actividad de alfa-1 Pl se incrementó 61,1 veces con un rendimiento del 20%.

Burnouf y otros, Vox. Sang. 52, 291-297 (1987), empezando con sobrenadante A de plasma (equivalente a la Fracción de Cohn II + III) utilizaron cromatografía DEAE y cromatografía de exclusión por tamaño para producir un a-1 Pl que tenía un 80-90% de pureza (mediante SDS-PAGE) con un incremento de 36 veces en la pureza. La recuperación fue del 65-70% a partir del sobrenadante A.

Hein y otros, Eur. Respir. J. 9: 16s-20s (1990) y la patente de Estados Unidos No. 4.697.003 de titularidad compartida, presentan un procedimiento que emplea Fracción de Cohn IV-1 como material de partida y utiliza la precipitación fraccionada de a-1 Pl con polietilenglicol, seguido por cromatografía de intercambio aniónico en DEAE Sepharose@. El producto final tiene una pureza de aproximadamente el 60% con un rendimiento del 45%.

Dubin y otros, Prep. Biochem. 20: 63-70 (1990) han mostrado una purificación cromatográfica de dos etapas. En primer lugar, se eluyeron a-1 Pl, inhibidor de Cl, a-1 antiquimotripsina e inhibidor de ínter a-1 tripsina-1 de Blue Sepharose@ y, a continuación, se purificó a-1 Pl mediante filtración en gel. Los datos de pureza y rendimiento no estaban disponibles.

Ballieux y otros purificaron un complejo de a-1 Pl y proteinasa-3 a partir de un esputo purulento utilizando cromatografía de afinidad de 4-fenilbutilamina, intercambio catiónico, y una etapa final de inmunoafinidad (Ballieux, B. E. y otros, J. Immunol. Methods 159: 63-70 (1993)). El pH del tampón utilizado en la etapa de intercambio catiónico fue de 7,0. En las condiciones utilizadas, la mayoría de las proteínas de esputo se unieron a la resina, pero ot-1 Pl y proteinasa-3 pasaron a través sin unirse.

Jordán y otros, patente de Estados Unidos No. 4.749.783 (1988) dieron a conocer un procedimiento en el que se eliminaron proteínas biológicamente inactivas de una preparación mediante cromatografía de afinidad después de una etapa de desactivación viral. La base de la separación entre las formas nativa y desnaturalizada de la proteína era la actividad biológica de la proteína nativa hacia la resina de afinidad y no las diferencias físicas entre las proteínas nativa y desnaturalizada.

Lebing y Chen, copropietarios de la patente de Estados Unidos No. 5.610.285, dieron a conocer un procedimiento en el que se capturó ot-1 Pl de la suspensión en pasta IV-1 utilizando una etapa de cromatografía DEAE. La solución recogida se ultrafiltró, a continuación se aplicó a una columna de catión S para la purificación inicial. Se recogió alfa-1 Pl como la fracción que atravesaba el flujo. El producto, en una solución de sacarosa, se trató a continuación con TNBP/colato a efectos de desactivar los virus. Después de la filtración y ultrafiltración, el producto se aplicó a una segunda columna de catión S para la purificación final. Una vez que el producto se formuló y se liofilizó, se desactivó viralmente una segunda vez mediante calentamiento hasta 80°C durante 72 horas. La pureza del producto y la seguridad frente al virus se mejoraron de manera considerable en comparación con el procedimiento de Hein, descrito anteriormente, pero, en la práctica, el procedimiento de Lebing y Chen era demasiado intensivo en recursos para la fabricación a gran escala.

Coan y otros (patente de Estados Unidos No. 4379087A) dieron a conocer un procedimiento para separar la alfa-1 Pl del plasma sanguíneo o fracciones del plasma sanguíneo que contienen Pl. El plasma sanguíneo se fracciona para proporcionar una fracción de Cohn que contiene Pl. Se prepara una solución acuosa de la fracción de Cohn que contiene Pl y se ajusta el pH de la solución a aproximadamente 6,5-8,5. Después de un periodo de mantenimiento de 0,2-24 horas a 2°-50°, se añade un poliglicol policondensado, por ejempio, poiietiiengiicoi (PEG), a la solución, el pH de la cual se ajusta a continuación hasta aproximadamente 4,6-5,9 para precipitar proteínas no deseadas del efiuente en el que se retiene una proporción dei Pi. Ei efíuente se trata para separar ei Pi dei mismo de forma directa o con purificación adicional.

La patente de Estados Unidos No. 6093804 da a conocer ia separación de) inhibidor de proteinasa a)fa (AP)) activo del inactivo en un procedimiento de separación individua) en una cotumna de intercambio aniónico. Se puede conseguir una purificación adiciona) mediante ei paso dei eiuato de ia etapa de intercambio aniónico a través de una resina de intercambio catiónico. Ei procedimiento impiica, en genera), ia eiiminación de iipoproteínas de una suspensión inicia) de proteínas mediante ia utiiización de un agente de eiiminación de iípidos, seguido de separaciones sucesivas con resinas de intercambio aniónico y catiónico con eiuyentes específicos.

Se necesita un procedimiento para ia purificación de a-1 Pi que mejore ei rendimiento y ia pureza de) a-1 Pi, que requiera un tiempo de producción más corto y utiiice menos recursos (taies como reactivos,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para purificar el inhibidor de proteinasa a-1 a partir de una sotución acuosa que contiene inhibidor de proteinasa alfa-1, que comprende las etapas de:

(a) eliminar una parte de proteínas contaminantes de la solución acuosa para obtener una sotución purificada que contiene inhibidor de proteinasa atfa-1, en e! que dicha etapa de eliminación comprende ¡as etapas de:

(i) precipitar dicha parte de proteínas contaminantes de dicha sotución acuosa mediante ¡a adición de un polietilenglicol con un PM entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 4.000 a dicha sotución acuosa a una concentración entre et 3% y et 15% en peso por votumen, y ajustar et pH de dicha sotución acuosa de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0; y

(¡i) separar dicha parte precipitada de proteínas contaminantes de dicha sotución acuosa, obteniendo de este modo dicha solución purificada que contiene inhibidor de proteinasa atfa-1; a continuación

(b) diluir dicha solución purificada para reducir ¡a conductividad de dicha sotución purificada, de manera que et inhibidor de proteinasa alfa-1 se une a una resina de intercambio aniónico; a continuación

(c) pasar dicha solución purificada a través de una resina de intercambio aniónico, de manera que et inhibidor de proteinasa alfa-1 se une a dicha resina de intercambio aniónico; a continuación

(d) eluir el inhibidor de proteinasa atfa-1 de dicha resina de intercambio aniónico para obtener una sotución etuida que contiene inhibidor de proteinasa atfa-1; a continuación

(e) ajustar el pH, la conductividad y ¡a concentración de proteína de dicha sotución etuida que contiene inhibidor de proteinasa alfa-1, de manera que et inhibidor de proteinasa atfa-1 no se une a una resina de intercambio

catiónico;

(f) pasar la solución etuida a través de una resina de intercambio catiónico; y

(g) recoger el flujo que atraviesa dicha resina de intercambio catiónico que contiene inhibidor de proteinasa alfa-1.

2. Procedimiento para purificar et inhibidor de proteinasa a-1 a partir de ¡a Fracción de Cohn tV-1, que comprende

las etapas de:

(a) eliminar una parte de proteínas contaminantes de la Fracción de Cohn IV-1 a efectos de obtener una solución purificada que contiene inhibidor de proteinasa alfa-1, en el que dicha etapa de etiminación comprende las etapas de:

(i) precipitar dicha parte de proteínas contaminantes de dicha Fracción de Cohn ¡V-1 mediante la adición de un polietilenglicol con un PM entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 4.000 a dicha Fracción de Cohn IV-1 a una concentración entre el 3% y el 15% en peso por volumen, y ajustar el pFI de dicha Fracción de Cohn IV-1 a de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0; y

(ii) separar dicha parte precipitada de proteínas contaminantes de dicha Fracción de Cohn IV-1, obteniendo de este modo dicha sotución purificada que contiene inhibidor de proteinasa atfa-1; a continuación

(b) ajustar la conductividad de dicha sotución purificada, de manera que el inhibidor de proteinasa alfa-1 se une a una resina de intercambio aniónico; a continuación

(c) pasar dicha solución purificada a través de ¡a resina de intercambio aniónico, de manera que el inhibidor de proteinasa alfa-1 se une a dicha resina de intercambio aniónico; y a continuación

(d) eluir el inhibidor de proteinasa a¡fa-1 de dicha resina de intercambio aniónico para obtener una solución eluida que contiene inhibidor de proteinasa atfa-1; a continuación

(e) ajustar el pH, la conductividad y ¡a concentración de proteína de dicha solución etuida que contiene inhibidor de proteinasa alfa-1, de manera que e! inhibidor de proteinasa alfa-1 no se une a una resina de intercambio catiónico;

(f) pasar la solución eluida a través de una resina de intercambio catiónico; y

(g) recoger el flujo que atraviesa dicha resina de intercambio catiónico que contiene inhibidor de proteinasa alfa-1.

3. Procedimiento, según la reivindicación 2, en el que dicha etapa de eliminación comprende tas etapas de

(a) precipitar dicha parte de proteínas contaminantes de dicha Fracción de Cohn ¡V-1 mediante la adición de un polialquilenglicol a dicha Fracción de Cohn IV-1, y ajustar e! pFI de dicha Fracción de Cohn IV-1 a de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0; y

(b) separar dicha parte precipitada de proteínas contaminantes de dicha Fracción de Cohn IV-1, obteniendo de este modo dicha solución purificada que contiene inhibidor de proteinasa alfa-1.

4. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2, que comprende además la etapa, anterior a dicha etapa de elución, de lavar dicha resina de intercambio aniónico con una solución tampón para eüminar una parte de proteínas

contaminantes de dicha resina de intercambio aniónico, de manera que el inhibidor de proteinasa alfa-1 permanece unido a dicha resina de intercambio aniónico.

5. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2, que comprende además la etapa de desactivar virus antes de dicha etapa de ajuste.

6. Procedimiento, según la reivindicación 5, en el que dicha etapa de desactivación viral comprende las etapas de:

(a) añadir un detergente a dicha solución purificada para obtener una mezcla de detergente y solución purificada;

y

(b) ajustar el pH de dicha mezcla a de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,5.

7. Procedimiento, según la reivindicación 6, en el que dicho detergente es un detergente no iónico.

8. Procedimiento, según la reivindicación 7, en el que dicho detergente no iónico es Tween 20.

9. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2, que comprende además la etapa de eliminar virus de dicha solución

acuosa.

10. Procedimiento, según la reivindicación 9, en el que dicha etapa de eliminación viral comprende filtrar dicha solución acuosa mediante nanofiltración.

11. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha etapa de ajuste comprende diluir dicha solución purificada, de manera que dicha solución purificada tiene una conductividad de entre aproximadamente 2,0 mS y aproximadamente 6,0 mS.

12. Procedimiento, según la reivindicación 11, en el que dicha solución purificada está diluida con agua.

13. Procedimiento, según la reivindicación 12, en el que el agua contiene fosfato sódico.

14. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2, que comprende además la etapa de ajustar el pH de dicha solución purificada a entre aproximadamente 6,25 y aproximadamente 7,25 antes de pasar dicha solución purificada a través de la resina de intercambio aniónico.

15. Procedimiento, según la reivindicación 2, en el que la Fracción de Cohn IV-1 está suspendida en una solución acuosa.