Ultrafiltración/diafiltración en dos fases.

Método para concentrar una proteína de una solución que comprende la proteína,

comprendiendo el método:

a) ultrafiltrar la solución utilizando una primera membrana para formar una primera solución de fracción retenidaque comprende la proteína en una primera concentración, en la que la primera membrana tiene un corte depeso molecular suficiente para retener, como mínimo, una parte de la proteína presente en la solución;

b) diafiltrar la primera solución de fracción retenida con una solución acuosa utilizando la primera membranapara formar una segunda solución de fracción retenida que comprende la proteína a aproximadamente laprimera concentración;

c) formular la segunda fracción retenida que comprende la proteína diafiltrada con glicina y ajustar el pH; y

d) ultrafiltrar la segunda solución de fracción retenida utilizando una segunda membrana para formar unasolución final de fracción retenida que comprende la proteína a una segunda concentración, en el que lasegunda membrana tiene un corte de peso molecular de aproximadamente dos veces el corte de pesomolecular de la primera membrana, en el que la segunda concentración es superior a la primera concentración.

Ultrafiltración/diafiltración en dos fases SECTOR DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a métodos para preparar una formulación de proteína concentrada y composiciones que comprenden dicho preparado, en particular se refiere a métodos para preparar una formulación de un producto del plasma concentrado, en particular se refiere a métodos de preparación y composiciones que comprenden IgG concentrada.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Habitualmente, se utiliza únicamente un tipo de membrana de ultrafiltración para conseguir concentraciones finales de productos de plasma para formulación. La investigación ha demostrado que la ultrafiltración con cassette puede producir concentraciones más elevadas. Sin embargo, debido a la viscosidad más elevada y la concentración elevada de proteína, la recuperación del producto se reduce ampliamente a medida que la membrana tiende a obstruirse o a presentar incrustaciones. Los estudios también han demostrado que centrándose en concentraciones elevadas se evita la recuperación de la membrana después de la limpieza.

Por consiguiente, sería deseable dar a conocer un método para concentrar un producto del plasma para conseguir concentraciones finales más elevadas, a la vez que se minimiza la pérdida de rendimiento y el impacto en el tiempo de procesado.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

En un aspecto, la presente invención da a conocer un método para concentrar una proteína de una solución que comprende la proteína. El método comprende:

a) ultrafiltrar la solución utilizando una primera membrana para formar una primera solución de fracción retenida que comprende la proteína a una primera concentración, en el que la primera membrana tiene un corte de peso molecular suficiente para retener, como mínimo, una parte de la proteína presente en la solución; b) diafiltrar la primera solución de fracción retenida con una solución acuosa utilizando la primera membrana para formar una segunda solución de fracción retenida que comprende la proteína a aproximadamente la primera concentración; c) formular la segunda retención que comprende la proteína diafiltrada con glicina y ajustar el pH; y d) ultrafiltrar la segunda solución de fracción retenida utilizando una segunda membrana para formar una solución final de fracción retenida que comprende la proteína a una segunda concentración, en el que la segunda membrana tiene un corte de peso molecular de aproximadamente dos veces el corte de peso molecular de la primera membrana, en el que la segunda concentración es superior a la primera concentración.

En otro aspecto, la presente invención da a conocer un método para concentrar una proteína de una solución que comprende la proteína. El método comprende:

a) ultrafiltrar la solución utilizando una primera membrana para formar una primera solución de fracción retenida que comprende el producto del plasma a una primera concentración aproximadamente del 5%, en el que la primera membrana tiene un corte de peso molecular suficiente para retener, como mínimo, aproximadamente el 90% del producto del plasma; b) diafiltrar la primera solución de fracción retenida utilizando la primera membrana con agua para formar una segunda solución de fracción retenida que comprende el producto del plasma a aproximadamente la primera concentración; c) formular aproximadamente el 5% del producto de plasma diafiltrado de la etapa b) en glicina de aproximadamente 0, 16 a aproximadamente 0, 30 M, en el que la formulación comprende además ajustar el pH hasta aproximadamente 4, 3; y d) ultrafiltrar la segunda solución de fracción retenida utilizando una segunda membrana para formar una solución final de fracción retenida que comprende el producto del plasma a una segunda concentración de aproximadamente el 19% a aproximadamente el 21%, en el que la segunda membrana tiene un corte de peso molecular de aproximadamente dos veces el corte de peso molecular de la primera membrana, en el que la segunda concentración es superior a la primera concentración.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS

La figura 1 es un ejemplo que ilustra algunas realizaciones de diagrama de flujo del proceso que representa de manera esquemática un método de ultrafiltración/diafiltración de dos fases para producir una formulación con una concentración elevada de IgG. A, esquema basado en cromatografía de intercambio iónico; y B, esquema basado en el tratamiento con disolvente/detergente (D/D) .

La figura 2 muestra la viscosidad de una solución de proteína en función de la concentración de sal.

La figura 3 muestra la viscosidad de una solución de proteína en función de la concentración de proteína.

La figura 4 muestra la viscosidad de una solución de proteína en función de la temperatura.

La figura 5 muestra la viscosidad de una solución de proteína en función de la concentración de proteína.

La figura 6 muestra la viscosidad de una solución de proteína en función del pH para varios tiempos.

La figura 7 muestra el grado de formación de agregado en función del tiempo para varias concentraciones de proteína.

La figura 8 muestra el cambio en la formación de agregados en función del pH para varios tiempos.

La figura 9 muestra la formación de dímeros en función del pH para varios tiempos.

La figura 10 muestra la fragmentación de una proteína en función del pH para varios tiempos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Según la presente invención, de manera sorprendente, se ha descubierto que una estrategia de ultrafiltración/diafiltración progresiva de dos fases para concentrar una proteína puede proporcionar composiciones que comprenden la proteína concentrada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la presente invención da a conocer un concepto nuevo de concentración para conseguir una formulación de un producto del plasma final de concentración más elevada que puede ser adecuada para utilizaciones terapéuticas o profilácticas y/o la administración mediante un conjunto de métodos, que incluyen inyecciones subcutáneas.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "proteína" pretende incluir cualquier polipéptido recombinante o purificado, que incluye, aunque sin limitarse a éstos, un polipéptido natural, modificado o sintetizado, y multímeros, fragmentos (por ejemplo, un fragmento biológicamente activo) , o variantes de los mismos.

La proteína puede derivar de un ser humano o un ser no humano, que incluyen, aunque sin limitarse a éstos, perros, gatos, cerdos, caballos, vacas, pájaros, peces, anfibios, reptiles, transgénicos, etc.

El término "fragmento biológicamente activo" se refiere a un fragmento de una proteína que retiene, como mínimo, una de las funciones de la proteína de la que deriva. Por ejemplo, un fragmento biológicamente activo de un anticuerpo incluye un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo; un fragmento biológicamente activo de un receptor incluye un fragmento del receptor que aún puede unir su ligando; un fragmento biológicamente activo de un ligando incluye la parte de un ligando que aún se puede unir a su receptor; y un fragmento biológicamente activo de una enzima incluye la parte de la enzima que aún puede catalizar una reacción catalizada por la enzima de longitud completa.

En una realización, la proteína es un producto del plasma.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "producto del plasma" se refiere a una proteína que se puede caracterizar, en general, como un componente de la sangre o fracción de la sangre de un ser humano o un ser no humano. Por ejemplo, la fracción de γ-globulina de la sangre comprende proteínas, tales como inmunoglobulinas y proteína C reactiva. La fracción de α1-globulina contiene proteínas, tales como la α1-glicoproteína ácida, α1-antitripsina, y α1-lipoproteína. La fracción de α2-globulina contiene proteínas, tales como α2-macroglobulina, haptoglobulina, ceruloplasmina y un complemento específico de grupo. La fracción de β-globulina contiene proteínas, tales como transferrina, hemopexina, β1-lipoproteína, β2-microglobulina y componentes de complemento.

En algunas realizaciones, la proteína a concentrar es un anticuerpo. El término "anticuerpo", tal como se utiliza en el presente documento, incluye, aunque sin limitarse a éstos, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, composiciones de anticuerpos con especificidades de poliepítopo, anticuerpos biespecíficos y diacuerpos (“diabodies”) . Los anticuerpos pueden ser anticuerpos completos, por ejemplo, de cualquier isotipo (por ejemplo, IgG, IgA, IgE, IgM, IgD) , o fragmento... [Seguir leyendo]

1. Método para concentrar una proteína de una solución que comprende la proteína, comprendiendo el método:

a) ultrafiltrar la solución utilizando una primera membrana para formar una primera solución de fracción retenida que comprende la proteína en una primera concentración, en la que la primera membrana tiene un corte de peso molecular suficiente para retener, como mínimo, una parte de la proteína presente en la solución; b) diafiltrar la primera solución de fracción retenida con una solución acuosa utilizando la primera membrana para formar una segunda solución de fracción retenida que comprende la proteína a aproximadamente la primera concentración; c) formular la segunda fracción retenida que comprende la proteína diafiltrada con glicina y ajustar el pH; y d) ultrafiltrar la segunda solución de fracción retenida utilizando una segunda membrana para formar una solución final de fracción retenida que comprende la proteína a una segunda concentración, en el que la segunda membrana tiene un corte de peso molecular de aproximadamente dos veces el corte de peso molecular de la primera membrana, en el que la segunda concentración es superior a la primera concentración.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que la proteína es un producto del plasma.

3. Método, según la reivindicación 1, en el que la primera membrana es una membrana de polietersulfona de tipo 20 C-screen que tiene un corte de peso molecular de 50 kDa.

4. Método, según la reivindicación 1, en el que la primera concentración es aproximadamente el 5% en proteína (p/v) .

5. Método, según la reivindicación 1, en el que la solución acuosa es agua.

6. Método, según la reivindicación 1, en el que el excipiente es glicina.

7. Método, según la reivindicación 1, en el que la segunda membrana es una membrana de fibras huecas. 30

8. Método, según la reivindicación 1, en el que la segunda membrana tiene un corte de peso molecular de 100 kDa.

9. Método, según la reivindicación 1, en el que la segunda concentración es, como mínimo, aproximadamente el

19% en proteína (p/v) . 35

10. Método, según la reivindicación 1, en el que la primera membrana tiene un corte de peso molecular suficiente para retener, como mínimo, el 90% de la proteína presente en la solución.

11. Método, según la reivindicación 4, en el que la primera concentración es aproximadamente el 5%, en el que, en

la etapa c) , aproximadamente el 5 % de la proteína diafiltrada se formula en aproximadamente 0, 16 a aproximadamente 0, 30 M de glicina y el pH se ajusta a aproximadamente 4.3.

12. Método para concentrar una proteína de una solución que comprende la proteína, según la reivindicación 1, comprendiendo el método:

a) ultrafiltrar la solución utilizando una primera membrana para formar una primera solución de fracción retenida que comprende la proteína a una primera concentración de aproximadamente el 5%, en el que la primera membrana tiene un corte de peso molecular suficiente para retener, como mínimo, aproximadamente el 90% de la proteína;

b) diafiltrar la primera solución de fracción retenida utilizando la primera membrana con agua para formar una segunda solución de fracción retenida que comprende la proteína a aproximadamente la primera concentración; c) formular aproximadamente el 5 % de la proteína diafiltrada de la etapa b) en aproximadamente 0, 16 a aproximadamente 0, 30 M de glicina, en el que la formulación comprende además ajustar el pH hasta 55 aproximadamente 4, 3; y d) ultrafiltrar la segunda solución de fracción retenida utilizando una segunda membrana para formar una solución final de fracción retenida que comprende la proteína a una segunda concentración de aproximadamente el 19 a aproximadamente el 21 %, en el que la segunda membrana tiene un corte de peso molecular de aproximadamente dos veces el corte de peso molecular de la primera membrana, en el que la 60 segunda concentración es superior a la primera concentración.

13. Método, según la reivindicación 1 ó 12, en el que la proteína es IgG.

14. Método, según la reivindicación 13, en el que la primera membrana tiene un corte de peso molecular de aproximadamente 25 kDa a aproximadamente 75 kDa.

15. Método, según la reivindicación 14, en el que la primera membrana tiene un corte de peso molecular de aproximadamente 50 kDa, en el que la segunda membrana tiene un corte de peso molecular de aproximadamente 100 kDa.