Planta y semilla de maíz correspondiente al evento transgénico MON89034 y procedimientos para su detección y uso.

Una planta de maíz resistente a insectos, o partes de la misma o semillas de la misma o progenie de la misma,

que comprende una molécula de ADN que codifica Cry2Ab and Cry1A.105 en el genoma en las células de dicha planta de maíz, partes de la misma o progenie de la misma, en la que la molécula de ADN comprende los elementos siguientes: promotor e35S, líder sin traducir CAB de trigo, intrón de la actina del arroz, secuencia de codificación para Cry1A.105, secuencia de terminación y poliadenilación de HSP17 3' de trigo, promotor de FMV, intrón hsp70, secuencia de codificación del péptido dirigido a la subunidad pequeña en el cloroplasto de rubisco, secuencia de codificación de Cry2Ab, secuencia señal de poliadenilación y de terminación de nos en 3`, en la que los extremos colocados opuestos de dicha molécula de ADN son un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 y un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2, y en la que dicha molécula de ADN está presente en el evento de maíz MON89034 depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) con nº de acceso PTA-7455.

Planta y semilla de maíz correspondiente al evento transgénico MON89034 y procedimientos para su detección y uso Campo de la invención La presente invención se refiere a plantas de maíz transgénicas (evento de maíz MON89034) y a partes de plantas y semillas de las mismas que exhiben resistencia a la infestación por insectos con insectos del orden Lepidoptera. La invención también se refiere a procedimientos para usar plantas y semillas que comprenden ADN que son diagnósticos para la presencia del evento transgénico cuando sondan para la presencia de secuencias de nucleótidos que son únicas del evento transgénico, y a procedimientos para detectar la presencia de dicho evento de maíz en una muestra biológica detectando secuencias de nucleótidos específicas que son únicas del evento transgénico. La invención proporciona secuencias de nucleótidos que son únicas del evento.

Antecedentes de la invención La presente invención se refiere a la variedad transgénica resistente a lepidópteros de la planta de maíz (Zea mays) denominada en el presente documento evento MON89034 y a secuencias de AND únicas presentes que, cuando se detectan en cualquier muestra o variedad de maíz, es diagnóstica de la presencia del evento de la planta de maíz transgénico MON89034 en dicha muestra o variedad, y también se refiere a la detección de la región de inserción transgénica/genómica en MON89034 de maíz y a plantas y semillas de la progenie derivadas de los mismos.

El evento de la planta de maíz MON89034 es particularmente resistente a insectos de la familia de los lepidópteros, tales como cogollero del maíz (Spodoptera frugiperda) , taladro europeo del maíz (Ostrinia nubilalis) , gusano elotero del maiz (Helicoverpa zea) , talador del maíz del suroeste (Diatraea grandiosella) , y gusano gris (Agrotis ipsilon) y similares, todos os cuales sin plagas de insectos agronómicamente importantes.

El maíz es un cultivo importante y es una fuente de alimentación fundamental en muchas zonas del mundo. Se han aplicado al maíz procedimientos de biotecnología con objeto de mejorar los rasgos agronómicos y la calidad del producto. Uno de estos rasgos agronómicos es la resistencia a los insectos, por ejemplo la resistencia modificada genéticamente a especies de lepidópteros y de coleópteros que emerge en las plantas de maíz modificadas genéticamente para que contengan uno o más genes que codifican agentes insecticidas (véase, por ejemplo, el documento WO 2004/020636, la patente de EE.UU. 6.489.542 y la patente de EE.UU. 6.620.988) . Es ventajoso detectar la presencia de un evento transgénico concreto en una muestra biológica para determinar su una o más progenies de un cruce sexual contienen el material transgénico. Por ejemplo, la detección del evento en una muestra es importante con fines licenciatarios, para establecer y mantener las normas de pureza, importante para cumplir con las agencias reguladoras, para cumplir las normas relacionadas con los ingredientes alimentarios, para usar en procedimientos legales con el fin de establecer si uno o más individuos o entidades ha estado usando el evento concreto sin una licencia del propietario o licenciatario de cualquier patente dirigida al evento transgénico y para asegurar el cumplimiento de varios reglamentos y/o legislaciones gubernamentales.

Además, los procedimientos que permiten la detección de una planta concreta serían útiles para cumplir los reglamentos que requiere la preaprobación para el mercado y etiquetado de alimentos derivados de las plantas de cultivos recombinantes. Los individuos o entidades resistentes a la presencia de un evento transgénico en una muestra también desean procedimientos fiables para detectar la presencia del transgén en una muestra con el fin de poder capitalizar sus negocios, lo que se aprovecha de una ausencia de transgenes en sus productos.

A pesar de estas ventajas, es posible que los insectos puedan desarrollar resistencias a las plantas que solo expresen una endotoxina δ de B. thuringiensis. Dicha resistencia, si se extiende, limitaría claramente el valor comercial del germoplasma que contiene genes únicos de Bt.

Un posible modo de aumentar la eficacia de los agentes insecticidas proporcionados mediante plantas transgénicas y dirigidos al control de plagas de insectos diana y de reducir de forma contemporánea la probabilidad de emergencia de plagas de insectos resistentes a dichos agentes insecticidas sería asegurar que dichos cultivos transgénicos expresan niveles altos de estos agentes insecticidas, tales como endotoxinas delta de Bacillus thuringiensis (McGaughey y Whalon (1992) , Science 258:1451-55; Roush (1994) Biocontrol. Sci. Technol. 4:501516) . Además, tener un depósito de genes insecticidas que son eficaces contra grupos de plagas de insectos y que manifiestan sus efectos a través de diferentes modos de acción puede proteger contra el desarrollo de resistencia. El inicio de la resistencia podría retrasarse sustancialmente como resultado de proporcionar un cultivo que exprese dos o más actividades insecticidas que exhiban toxicidad solapante con las mismas especies de insectos. Un medio para alcanzar dichos modos de acción duales podría proporcionar una planta que expresa un gen Bt tóxico para una especie de insecto concreto junto con un ARNds que se proporciona para los fines de dirigir la supresión de un gen esencial de la misma especie de insecto dirigido por la toxina Bt, provocando el ARNds una respuesta de ARNi tras a ingestión por la plaga diana, lo que proporciona un medio para la redundancia del evento que el insecto desarrolle

resistencia al ARNds o al gen Bt. Como alternativa, la coexpresión en una planta de dos o más toxinas insecticidas tóxicas ambas a la misma especie de insecto pero cada una con un modo diferente de efectuar su actividad de destrucción, en particular cuando ambos se expresan a niveles altos, proporciona un medio para el control eficaz de la resistencia. Ejemplos de dichos insecticidas útiles en dichas combinaciones incluyen, entre otros, toxinas de Bt, proteínas insecticidas de Xenorhabdus sp. o Photorhabdus sp, proteínas y/o permuteínas de patatina desalegernizadas y desglucosiladas, lectinas vegetales y similares.

La expresión de genes extraños en plantas se sabe que está influida por su posición en el cromosoma, quizá a causa de la estructura de la cromatina (p. ej., heterocromatina) o la proximidad de elementos de regulación de la transcripción (p. ej, potenciadores) cercanos al sitio de integración (Weising et al. (19880 Ann. Rev. Genet 22:421477) . Por esta razón, a menudo es necesario realizar una detección selectiva de un gran número de eventos con el fin de identificar cualquier evento caracterizado por la expresión óptima de un gen de interés introducido. Incluso entonces, con docenas o incluso cientos de diferentes eventos transgénicos a mano, no existe certeza de éxito en la identificación de un único evento transgénico que proporcione los niveles óptimos de expresión de al menos dos toxinas o agentes insecticidas diferentes y carece de deficiencias agronómicas indeseables o de efectos fitotóxicos, bien como resultado de la inserción en alguna región esencial o parcialmente esencial del genoma vegetal o como resultado de efectos tóxicos producidos por los niveles de expresión de los transgenes. Por ejemplo, se ha observado en plantas y en otros organismos que puede haber una amplia variación en los niveles de expresión de un gen introducido entre los eventos. También puede haber diferencias en los patrones de expresión espaciales y temporales, por ejemplo diferencias en la expresión relativa de un transgén en varios tejidos vegetales, que pueden no corresponder con los patrones previstos a partir de elementos reguladores de la transcripción presentes en la construcción génica introducida. Por este motivo, es habitual producir varios cientos o varios miles de eventos diferentes y cribar los eventos para buscar un único evento que tenga los niveles de expresión del transgén deseado y los patrones para fines comerciales. Un evento que tiene los niveles o patrones deseados de la expresión del transgén es útil para la introgresión del transgén en otros fondos genéticos mediante cruzamiento sexual usando métodos de cultivo convencionales. La progenie de dichos cruces mantiene las características de la expresión del transgén del transformante original. Esta estrategia se usa para garantizar una expresión génica fiable en una serie de variedades que están adaptadas adecuadamente a las condiciones de crecimiento local específicas.

Es posible detectar la presencia de un transgén mediante cualquier procedimiento de detección de ácido nucleico conocido, tal como la reacción en cadena de la polimerasa... [Seguir leyendo]

1. Una planta de maíz resistente a insectos, o partes de la misma o semillas de la misma o progenie de la misma, que comprende una molécula de ADN que codifica Cr y 2Ab and Cr y 1A.105 en el genoma en las células de dicha planta de maíz, partes de la misma o progenie de la misma, en la que la molécula de ADN comprende los elementos siguientes: promotor e35S, líder sin traducir CAB de trigo, intrón de la actina del arroz, secuencia de codificación para Cr y 1A.105, secuencia de terminación y poliadenilación de HSP17 3' de trigo, promotor de FMV, intrón hsp70, secuencia de codificación del péptido dirigido a la subunidad pequeña en el cloroplasto de rubisco, secuencia de codificación de Cr y 2Ab, secuencia señal de poliadenilación y de terminación de nos en 3‘, en la que los extremos colocados opuestos de dicha molécula de ADN son un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 y un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2, y en la que dicha molécula de ADN está presente en el evento de maíz MON89034 depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) con nº de acceso PTA-7455.

2. La planta de maíz resistente a insectos, o partes de la misma o semillas de la misma o progenie de la misma de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº 5.

3. Una composición derivada de la planta de maíz o partes de la misma como se define en la reivindicación 1 o 2, en la que dicha composición comprende una cantidad detectable de una molécula de ADN que codifica Cr y 2Ab y Cr y 1A.105 y ADN que tiene las secuencias de nucleótidos de SEC ID Nº 1 y 2, como se define en las reivindicaciones 1 o 2, y en la que dicha composición es un producto seleccionado de harina de maíz, aceite de maíz, torta de maíz, semilla de maíz, germen de maíz, almidón de maíz, harina de maíz, polen de maíz, barbas de maíz, licor de maceración de maíz, malta de maíz, azúcar de maíz, jarabe de maíz, margarina producida de aceite de maíz, sólidos de productos secos de destilación (DDGS) , agente cosmético o formador de volumen.

4. Un procedimiento para producir una planta de maíz resistente a insectos, que comprende

(a) transformar una célula de planta de maíz con una secuencia de nucleótidos que comprende la SEC ID Nº 5; Y

(b) regenerar una planta de maíz a partir de dicha célula transformada, en la que dicha planta de maíz comprende dicha molécula de ADN y es resistente a insectos.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, que además comprende:

(c) seleccionar progenie que comprende secuencias de nucleótidos de SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 2, en la que dicha progenie seleccionada es una planta de maíz resistente a insectos, preferentemente dicha etapa de selección (c) incluye someter dicha planta obtenida en (b) a una reacción de amplificación de ácido nucleico, en la que se selecciona la progenie que produce un amplicón que comprende al menos una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 2, o someter dicha al menos una planta progenie obtenida de (b) a una reacción de hibridación de ácido nucleico, en la que se selecciona la progenie hibrida con una sonda que hibrida en condiciones rigurosas con una o más secuencias de ADN seleccionadas de la SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 2.

6. Un procedimiento de protección de una planta de maíz de la infestación de insectos, que comprende proporcionar en la dieta de una plaga de lepidópteros del maíz una cantidad insecticidamente eficaz de célula (s) o tejido (s) de la planta de maíz, o partes de la misma, de la reivindicación 1 o 2.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicha plaga de lepidópteros se selecciona del cogollero del maíz (Spodoptera frugiperda) , taladro europeo del maíz (Ostrinia nubilalis) , gusano elotero del maíz (Helicoverpa zea) , taladro del maíz del suroeste (Diatraea grandiosella) y gusano gris (Agrotis ipsilon) .

8. Un par de moléculas de ADN que comprenden: una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, en el que dicha molécula de ADN comprende al menos 18 nucleótidos contiguos de cualquier porción de la región de ADN de la SEC ID Nº 3 o la SEC ID Nº 5, o complementarias de las mismas, y dicha segunda molécula de ADN comprende una longitud similar de un ADN genómico de maíz flanqueante en 5´ de SEC ID Nº 3 o complementaria de la misma para funcionar como cebadores de ADN o sondas diagnósticas para el ADN extraído de la planta de maíz MON89034 o progenie de la misma.

9. El par de moléculas de ADN de la reivindicación 8, en el que:

(i) dicha primera molécula de ADN comprende al menos 18 nucleótidos contiguos complementarios de la porción de ADN insertada heterólogo de SEC ID Nº 5 y en la que dicha segunda molécula de ADN comprende al menos 18 nucleótidos contiguos de la porción del genoma de maíz de SEC ID Nº 3; o

(ii) dicha molécula de ADN hibrida específicamente con la SEC ID Nº 5 de aproximadamente la posición nucleotídica 2060 hasta aproximadamente la posición nucleotídica 12.208 y en la que dicha segunda molécula de ADN hibrida

específicamente con la secuencia complementaria inversa correspondiente a la SEC ID Nº 3 de aproximadamente la posición nucleotídica 1 a aproximadamente la posición nucleotídica 2.050.

10. Un par de moléculas de ADN que comprenden: una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, en el que dicha molécula de ADN comprende al menos 18 nucleótidos contiguos de cualquier porción de la región de ADN de la SEC ID Nº 4 o la SEC ID Nº 5, o complementarias de las mismas, y dicha segunda molécula de ADN comprende una longitud similar de un ADN genómico de maíz flanqueante en 3´ de SEC ID Nº 4 o complementaria de la misma para funcionar como cebadores de ADN o sondas diagnósticas para el ADN extraído de la planta de maíz MON89034 o progenie de la misma.

11. El par de moléculas de ADN de la reivindicación 10, en el que:

(i) dicha primera molécula de ADN comprende al menos 18 nucleótidos contiguos de la porción de ADN insertada heterólogo de SEC ID Nº 5 y en la que dicha segunda molécula de ADN comprende al menos 18 nucleótidos contiguos de la porción del genoma de maíz de SEC ID Nº 4; o

(ii) dicha molécula de ADN hibrida específicamente con la secuencia complementaria inversa correspondiente a la SEC ID Nº 5 desde aproximadamente la posición nucleotídica 1 hasta aproximadamente la posición nucleotídica

11.305 y en la que dicha segunda molécula de ADN hibrida específicamente con la SEC ID Nº 4 desde aproximadamente la posición nucleotídica 21 a aproximadamente la posición nucleotídica 914.

12. El par de moléculas de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que:

(i) dicha primera molécula de ADN comprende la SEC ID Nº 6 y dicha segunda molécula de ADN comprende la SEC ID Nº 7; o

(ii) dicha primera y segunda molécula de ADN comprende al menos 30 nucleótidos contiguos de SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4 o SEC ID Nº 5.

13. Un procedimiento de detección de la presencia de una molécula de ADN seleccionada de las SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, and SEC ID Nº 5 en una muestra biológica, comprendiendo el procedimiento:

(a) poner en contacto dicha muestra biológica con un par de cebadores de ADN que comprende moléculas de ADN de al menos 18 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 3 o su complementaria, la SEC ID Nº 4 o su complementaria, la SEC ID Nº 5 o su complementaria, para funcionar como cebadores de ADN o sondas diagnósticos del ADN extraído de la planta de maíz MON89034 o progenie de la misma;

(b) proporcionar una condición de reacción de amplificación de ácido nucleico;

(c) realizar dicha reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo de este modo una molécula amplicón de ADN; y

(d) detectar dicha molécula amplicón de ADN en la que la detección de un amplicón que comprende al menos una de la SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2 y complementarias de las mismas es indicativo de dicha molécula de ADN en dicha muestra biológica.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicha muestra biológica es una muestra de ADN extraída de una planta de maíz.

15. Un procedimiento de detección de la presencia de una molécula de ADN seleccionada de las SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, and SEC ID Nº 5 en una muestra biológica, comprendiendo el procedimiento:

(a) poner en contacto dicha muestra biológica con una sondad de ADN que hibrida en condiciones rigurosas con dicha molécula de ADN y no hibrida en las condiciones rigurosas con una muestra biológica que no contiene dicha molécula de ADN:

(b) someter dicha muestra biológica y sonda de ADN a condiciones de hibridación rigurosas; y

(c) detectar la hibridación de dicha sonda de ADN a dicha muestra biológica, en la que la detección de hibridación es indicativa de la presencia de dicha molécula de ADN en dicha muestra biológica.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que:

(i) dicha muestra biológica es una muestra de ADN extraída de una planta de maíz; y/o

(ii) dicha sonda de ADN comprende la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2, o complementaria de las mismas; y/o

(iii) dicha sonda de ADN está marcada con al menos un fluoróforo.

17. El procedimiento de la reivindicación 13 o 15, en la que dicha muestra biológica se selecciona de harina de maíz, aceite de maíz, torta de maíz, semilla de maíz, germen de maíz, almidón de maíz, harina de maíz, polen de maíz, barbas de maíz, licor de maceración de maíz, malta de maíz, azúcar de maíz, jarabe de maíz, margarina producida de aceite de maíz, sólidos de productos secos de destilación (DDGS) , agente cosmético o formador de volumen.

18. Un kit de detección de ADN que comprenden: al menos una molécula de ADN que comprende al menos 18 nucleótidos contiguos homólogos o complementarios a las SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, o SEC ID Nº 5, para funcionar como cebador o sonda de ADN específico del evento de maíz MON89034 y/o su progenie.

19. El kit de detección de ADN de la reivindicación 18, en el que (i) dicha al menos una molécula de ADN comprende las SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, o complementarias de las mismas, preferentemente dicha al menos una molécula de ADN es la SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, o complementarias de las mismas; o (ii) dicho kit comprende un par de moléculas de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14.

20. Un procedimiento de determinar la cigosidad del ADN de una planta de maíz que comprende el evento de maíz MON89034 en una muestrea biológica que comprende:

(a) poner en contacto dicha muestra con un conjunto de cebadores que comprenden las SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, y SEC ID Nº 10, que (1) cuando se usan juntas en una reacción de amplificación de ácido nucleico que comprende ADN del evento de maíz MON89034, produce un primer amplicón que es diagnóstico del evento de maíz MON89034 y (2) cuando se usa en una reacción de amplificación de ácido nucleico que comprende ADN genómico distinto al ADN de MON89034 produce un segundo amplicón que es diagnóstico del ADN genómico de maíz distinto al ADN de MON89034.

(b) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico; y

(c) detectar los amplicones producidos de este modo, en los que la detección de la presencia de ambos amplicones indica que dicha muestra es heterocigota del ADN del evento de maíz MON89034, en el que la detección de sólo el primer amplicón indica que dicha muestra es homocigota para el ADN del evento de maíz MON89034.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que dicho conjunto de cebadores se usa adicionalmente con las SEC ID Nº 14 y la SEC ID Nº 15.

22. Un procedimiento de detectar la presencia del ADN correspondiente al ADN de planta de maíz MON89034 en una muestra, comprendiendo el procedimiento:

(a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con un par de cebadores que cuando se usan en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico de la planta de maíz MON89034, produce un amplicón que comprende las SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2; y

(b) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, de modo se produce el amplicón; y

(c) detectar al amplicón.

23. Un procedimiento de detectar la presencia del ADN correspondiente al ADN de planta de maíz MON89034 en una muestra, comprendiendo el procedimiento:

(a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con una sonda que hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con ADN genómico de la planta de maíz MON89034 y no hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con una planta de maíz control, en el que dicha sonda es homóloga o complementaria de la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2; y

(b) someter la muestra biológica y la sonda de de las condiciones de hibridación rigurosas; y

(c) detectar la hibridación de la sonda al ADN.