Procedimiento para obtener ARN corto así como kit para el mismo.

Procedimiento para la obtención de al menos ARN corto con hasta 200 nucleótidos,

con al menos las siguientes etapas:

a) habilitar una disolución biológica que contiene al menos ARN corto así como proteínas y/o ácidos nucleicos largos (ARN largo y ADN);

b) separar las proteínas y los ácidos nucleicos largos de la disolución, precipitando al menos las proteínas y mezclando la disolución para la precipitación de las proteínas con iones de metales bivalentes, ajustándose la concentración de los iones de metales a 0,2 hasta 0,6 M;

c) adsorción del ARN corto a un (primer) soporte sólido después de la precipitación de las proteínas;

d) obtención del ARN corto mediante desorción del soporte.

Procedimiento para obtener ARN corto asï como kit para el mismo La presente invenciïn se refiere a un procedimiento de mïltiples etapas para la obtenciïn de al menos ARN corto con hasta 200 nucleïtidos, asï como un kit para el mismo.

En los ïltimos aïos se ha comprobado que en el caso de los ARNs cortos en cïlulas, no se trata de productos de degradaciïn sin importancia de ARN largo, p. ej. de ARNr o ARNm, sino que ïstos se sintetizan de un modo preestablecido. Juegan un papel esencial en la regulaciïn gïnica, la sïntesis de ARN, la modificaciïn de ARN y el corte y empalme de ARN en casi todos los organismos vivos y continuamente se descubren nuevas funciones y, con ello, campos de aplicaciïn. De manera correspondiente a su funciïn, estructura, localizaciïn en la cïlula o participantes en la reacciïn, estos ARNs pequeïos se subdividen en grupos tales como, p. ej., miARN, ARNsi, ARNsh, ARNsno, ARNscn, ARNpi, ARNtasi, ARNrasi, etc., cuyo nïmero aumenta asimismo constantemente.

Los ARNs cortos se presentan la mayorïa de las veces en forma de cadena sencilla y presentan tïpicamente longitudes en el intervalo de 17-35 nucleïtidos. Sin embargo, tambiïn existen ARNs de doble cadena tal como, p. ej., ARNsi o ARNsh, los cuales, sin embargo, para el despliegue de su efecto, han de ser transformados en cadenas sencillas.

Mientras que para la mayorïa de los ARNs cortos no se ha deducido todavïa por completo la biosïntesis y el modo de funcionamiento, para algunas especies ya se pudieron desarrollar aplicaciones interesantes desde un punto de vista econïmico y cientïfico. En este caso, son de particular interïs miARN y ARNsi.

Los miARNs (micro ARNs) son codificados en el nïcleo, se sintetizan en la cïlula y conducen a travïs de diversos mecanismos, por norma general, a la represiïn preestablecida de la expresiïn gïnica. Los genes afectados participan en este caso ante todo en el desarrollo, divisiïn y diferenciaciïn de las cïlulas. Se pudo demostrar que el perfil de expresiïn de miARN de cïlulas sanas se diferencia claramente del que se encuentra en cïlulas con un desarrollo perturbado, p. ej. en el caso del cïncer. Con un “perfilado de miARN” basado en chips, es decir, con la cuantificaciïn de un conjunto de miARNs, se ha vuelto posible mientras tanto una identificaciïn mucho mïs precisa de una enfermedad (cancerïgena) que la que permitïan los mïtodos actuales.

La formaciïn de ARNsi de doble cadena (ARN de interferencia corto) se emplea en casi todas las cïlulas vegetales y animales para la defensa frente a patïgenos. Despuïs de que un patïgeno se introduzca en el cïlula, se produce la mayorïa de las veces una forma intermedia de ARNm de doble cadena que es cortado en pequeïos ARNsi mediante complejos enzimïticos Dicer, propios de la cïlula. El propio ARNsi sirve entonces como sonda especïfica para la secuencia para el ARNm extraïo de la cïlula que, con ello, es identificado, cortado y hecho de esta manera inocuo por complejos de nucleasa especiales (RISC) . Esta represiïn en el plano del ARNm puede ser empleada entonces para reducir en su expresiïn a genes arbitrarios, por lo tanto tambiïn propios de la cïlula y, con ello, entre otros, las proteïnas correspondientes. Para ello, por ejemplo ARNsi sintetizado in vitro se introduce en las cïlulas, o se procura una sïntesis intracelular de ARNsi a travïs de sistemas de vectores. Los ARNs cortos en las cïlulas determinan que los genes diana, que vienen predeterminados por la secuencia de los ARNs cortos, sean reprimidos por los mecanismos arriba descritos. Con ello, se abre una posibilidad muy elegante y sencilla de inactivar de manera predeterminada genes individuales, lo cual tiene un gran valor en el caso de la investigaciïn de la regulaciïn gïnica y de la funciïn de las proteïnas. Con ello, este mïtodo es claramente superior a los procedimientos habituales tales como, por ejemplo, de la preparaciïn de mutantes inactivados, en relaciïn con los costes, complejidad y factibilidad general.

Para las aplicaciones mencionadas tales como transfecciïn con ARNsi o “perfilado de miARN”, pero tambiïn para la descodificaciïn ulterior de la estructura y mecanismos funcionales, es necesario purificar a partir de los materiales de muestra las especies de ARN activas de la forma mïs cuantitativa posible. Adicionalmente, el ARN corto debe ser ampliamente liberado de un fondo muy grande de ARN largo y proteïnas para la analïtica consecutiva que cada vez es mïs sensible. Esto exige elevados requisitos al mïtodo de extracciïn, dado que los ARNs cortos se presentan la mayorïa de las veces sïlo en cantidades traza.

Segïn el estado actual de la tïcnica, casi cada una de las purificaciones de ARN pequeïo se basa en el principio de separar del lisado de una muestra biolïgica primeramente las macromolïculas grandes tales como ADN, ARN largo y, en parte, tambiïn proteïna. El ARN pequeïo es precipitado a continuaciïn por parte del alcohol y luego es

aislado, la mayorïa de las veces a travïs de la uniïn a un soporte sïlido. El punto crïtico en el caso de este procedimiento es la separaciïn lo mïs completa posible de la proteïna antes de la precipitaciïn de ARN pequeïo, dado que de lo contrario, la proteïna co-precipita y dificulta mucho una purificaciïn ulterior del ARN pequeïo.

El documento WO 2005/012523 A1 describe un procedimiento para la obtenciïn de ARN corto con 100 nucleïtidos o menos, en el que la separaciïn de ADN y proteïna se lleva a cabo a travïs de una extracciïn lïquido-lïquido con fenol/cloroformo. Todo el ARN se encuentra despuïs de la extracciïn en la fase acuosa que debe a continuaciïn ser separado de la mayor parte de la fase orgïnica que contiene las proteïnas y de la interfase que contiene el ADN. Despuïs, mediante la adiciïn de alcohol a la fase acuosa se crea una condiciïn bajo la cual el ARN se une a un soporte sïlido.

En el caso de este procedimiento es desventajoso que el uso de fenol albergue un riesgo considerable para la salud del usuario, dado que el fenol es venenoso y cïustico. Ademïs, se puede manifestar difïcil retirar cuantitativamente la fase acuosa despuïs de la extracciïn lïquido-lïquido sin arrastrar con ello trazas de la interfase con ADN o de la fase fenïlica con proteïna. Si la fase acuosa no se separa por completo de este fondo, deben asumirse pïrdidas considerables en el rendimiento de ARN. Otro inconveniente de este procedimiento puede consistir en que la extracciïn lïquido-lïquido, y la separaciïn de fases ligada con ello, no pueda ser automatizada sin mïs. Ante todo en relaciïn con un posible diagnïstico rutinario futuro mediante “perfilado de miARN”, el proceso complejo y prolongado y la limitaciïn del rendimiento de la muestra mediante tratamiento manual representa un inconveniente agravante.

Por lo tanto, otros procedimientos renuncian a la extracciïn con disolventes orgïnicos. Asï, en el documento WO 2005/012487 A2 se propone un procedimiento en el que ARN largo y ADN se separan mediante cromatografïa en columna en presencia de pequeïas cantidades de alcohol. El ARN pequeïo permanece en disoluciïn y, despuïs de aumentar el contenido en alcohol, es unido a un segundo soporte.

Desventajoso en este procedimiento es el hecho de que las proteïnas, que se encuentran asimismo en disoluciïn, no son separadas por completo mediante el procedimiento. En el caso de un aumento del contenido en alcohol para la separaciïn del ARN pequeïo, las proteïnas, tal como se ha descrito antes, pueden co-precipitar y unirse con el ARN pequeïo al soporte. Entonces, apenas es ya posible una extracciïn por lavado completa de la proteïna. Otra desventaja resulta del hecho de que entre las proteïnas celulares se encuentran a menudo tambiïn ARNasas que sin una purificaciïn cuantitativa digieren los ARNs aislados y, con ello, reducen el rendimiento o bien contaminan mediante productos de degradaciïn, en el peor de los casos lo hacen incluso inaprovechable.

Otro procedimiento para la purificaciïn de especies de ARN pequeïo se describe en el documento US 2007/0202511 A1. Mediante la mezcladura simultïnea o secuencial de una disoluciïn con contenido en ARN con un reactivo caotrïpico y sales de metales del I y II grupos principales del Sistema Periïdico, se precipitan ARNs largos y ADN genïmico, mientras que molïculas de ARN corto pemanecen en disoluciïn. A continuaciïn, el sobrenadante que contiene el ARN corto se separa del precipitado, y los ARNs cortos se continïan purificando. Para ello, pasan a emplearse procedimientos de centrifugaciïn o diferentes procedimientos cromatogrïficos.

Lo desventajoso en el caso de este procedimiento es que tampoco en este caso... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la obtenciïn de al menos ARN corto con hasta 200 nucleïtidos, con al menos las siguientes etapas: 5

a) habilitar una disoluciïn biolïgica que contiene al menos ARN corto asï como proteïnas y/o ïcidos nucleicos largos (ARN largo y ADN) ;

b) separar las proteïnas y los ïcidos nucleicos largos de la disoluciïn, precipitando al menos las proteïnas y 10 mezclando la disoluciïn para la precipitaciïn de las proteïnas con iones de metales bivalentes, ajustïndose la concentraciïn de los iones de metales a 0, 2 hasta 0, 6 M;

c) adsorciïn del ARN corto a un (primer) soporte sïlido despuïs de la precipitaciïn de las proteïnas;

d) obtenciïn del ARN corto mediante desorciïn del soporte.

2. Procedimiento segïn la reivindicaciïn 1, caracterizado por que se separan uno de otro las proteïnas y los ïcidos nucleicos largos, y se obtiene u obtienen las proteïnas y/o el ARN largo.

3. Procedimiento segïn la reivindicaciïn 1 ï 2, caracterizado por que los ïcidos nucleicos largos se separan antes o con la precipitaciïn de las proteïnas de la disoluciïn.

4. Procedimiento segïn la reivindicaciïn 2 ï 3, caracterizado por que los ïcidos nucleicos largos se adsorben a un (segundo) soporte sïlido. 25

5. Procedimiento segïn la reivindicaciïn 4, caracterizado por que la disoluciïn para la adsorciïn de los ïcidos nucleicos largos se mezcla con un disolvente orgïnico, en particular miscible con agua, en una concentraciïn tal que sïlo los ïcidos nucleicos largos se adsorben al segundo soporte, ajustïndose la concentraciïn del disolvente orgïnico, en particular, a un intervalo de 15 a 40% en vol., preferiblemente de 20 a 30% en vol, de manera particularmente preferida a 25% en vol., en cada caso referida a la disoluciïn mezclada con el o los disolventes.

6. Procedimiento segïn la reivindicaciïn 4 ï 5, caracterizado por que la disoluciïn para la adsorciïn de los ïcidos nucleicos largos se mezcla con una sal de elevada fuerza iïnica, en particular una sal caotrïpica o varias sales caotrïpicas, cuya concentraciïn en la disoluciïn se ajusta a un intervalo de 1 a 10 M.

7. Procedimiento segïn una de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado por que de los ïcidos nucleicos adsorbidos al segundo soporte se separa ADN, en particular mediante digestiïn por DNasa, y se aïsla el ARN largo remanente ante todo del segundo soporte, eventualmente despuïs de un proceso de lavado.

8. Procedimiento segïn una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que la disoluciïn para la precipitaciïn de las proteïnas se mezcla con iones de metales que se eligen del grupo de los elementos Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Cd, Hg, Pb y Ba, y/o la concentraciïn de los iones de metales se ajusta en particular a 0, 3 hasta 0, 4 M.

9. Procedimiento segïn una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que para la adsorciïn del ARN corto 45 se utiliza una disoluciïn que contiene un disolvente orgïnico en elevada concentraciïn, ajustïndose la concentraciïn, en particular, a un valor de 30 a 80% en vol., preferiblemente de 40 a 70% en vol., de manera particularmente preferida de 50 a 60% en vol., en cada caso referida a la disoluciïn mezclada con el disolvente, y/o como disolvente orgïnico se utiliza un disolvente no alcohïlico, miscible con agua, el cual se elige, p. ej. del grupo al que pertenecen acetona, acetonitrilo, dimetilsulfïxido (DMSO) , tetrahidrofurano (THF) , dioxano y

dimetilformamida (DMF) .

10. Kit para llevar a cabo el procedimiento segïn una de las reivindicaciones 1 a 9, que contiene al menos a) al menos un soporte sïlido para la adsorciïn de ïcidos nucleicos;

b) un reactivo precipitador de proteïnas que contiene iones de metales bivalentes;

c) al menos una sustancia de uniïn para la adsorciïn selectiva de ARN corto a un soporte sïlido, siendo la sustancia de uniïn un disolvente orgïnico miscible con agua y no alcohïlico;

d) instrucciones con la descripciïn de las etapas del procedimiento segïn una de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Kit segïn la reivindicaciïn 10, caracterizado por que estï presente al menos una sustancia de uniïn para el ajuste de las condiciones de uniïn para la adsorciïn selectiva de ïcidos nucleicos largos a un soporte sïlido, en particular un disolvente orgïnico miscible con agua y/o una sal a base de una o mïs sales caotrïpicas en calidad de al menos una sustancia de uniïn y/o el kit presenta una DNasa para una digestiïn de ADN.

12. Kit segïn una de las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado por que los iones de metales bivalentes se eligen del grupo de los elementos a los que pertenecen Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Cd, Hg, Pb y Ba.

13. Kit segïn una de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado por que el disolvente orgïnico, miscible con agua y no alcohïlico se elige del grupo al que pertenecen acetona, acetonitrilo, dimetilsulfïxido (DMSO) , 15 tetrahidrofurano (THF) , dioxano y dimetilformamida (DMF) .

14. Kit segïn una de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado por que como soportes sïlidos estïn presentes partïculas, tambiïn en forma de polvo o suspensiones, polïmeros, membranas, capas de filtro, fritas, velos o soportes en forma de un monolito y/o el material para el soporte sïlido es sïlice, vidrio, cuarzo, zeolitas o mezclas de los mismos, y/o partïculas magnïticas, preferiblemente revestidas con sïlice, vidrio, cuarzo o zeolitas.

15. Kit segïn una de las reivindicaciones 10 a 14, caracterizado por que estï presente al menos un reactivo de eluciïn para la desorciïn de al menos el ARN corto del soporte y/o al menos un tampïn de lavado.