Obtención de perfil de expresión génica en tejidos tumorales biopsiados.

Método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de un paciente con cáncer de mama sin la recidiva de cáncer de mama,

tras la extirpación quirúrgica del tumor primario, que comprende

determinar mediante RT-PCR el nivel del transcrito de ARN de SURV en una muestra de tejido de cáncer de mama incrustado en cera, fijado obtenida de dicho paciente, normalizado frente al nivel de todos los transcritos de ARN sometidos a ensayo en dicha muestra, o un conjunto de referencia de transcritos de ARN,

en el que un aumento del nivel normalizado del transcrito de ARN de SURV en comparación con el nivel normalizado del transcrito de ARN de SURV en un conjunto de referencia de tejidos de cáncer de mama indica una reducción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo sin recidiva de cáncer de mama.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10158652.

Solicitante: GENOMIC HEALTH, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 301 PENOBSCOT DRIVE REDWOOD CITY, CA 94063 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: KIEFER, MICHAEL, C., BAKER,JOFFRE,B, SHAK,STEVE, CRONIN,MAUREEN,T, Walker,Michael G.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12M1/00 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12M EQUIPOS PARA ENZIMOLOGIA O MICROBIOLOGIA (instalaciones para la fermentación de estiércoles A01C 3/02; conservación de partes vivas de cuerpos humanos o animales A01N 1/02; aparatos de cervecería C12C; equipos para la fermentación del vino C12G; aparatos para preparar el vinagre C12J 1/10). › Equipos para enzimología o microbiología.
  • C12N15/09 C12 […] › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12N15/10 C12N 15/00 […] › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • G01N33/574 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › para el cáncer.

PDF original: ES-2486265_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Obtención de perfil de expresión génica en tejidos tumorales biopsiados

Campo de la invención La presente invención se refiere a la obtención del perfil de expresión génica en tejidos tumorales biopsiados. En particular, la presente invención se refiere a métodos sensibles para medir los niveles de ARNm en tejidos tumorales biopsiados, incluyendo material de biopsia incrustado en parafina archivado. Además, la invención proporciona un conjunto de genes cuya expresión es importante en el diagnóstico y tratamiento del cáncer de mama.

Los oncólogos disponen de varias opciones de tratamiento, incluyendo diferentes combinaciones de fármacos quimioterápicos que se caracterizan como “tratamiento de referencia”, y varios fármacos que no portan un declarado en la etiqueta para un cáncer particular, pero para los que hay pruebas de eficacia en ese cáncer. La mejor

probabilidad de un buen desenlace del tratamiento requiere que los pacientes se asignen al tratamiento contra el cáncer disponible óptimo, y que esta asignación se haga lo más rápidamente como sea posible tras el diagnóstico.

Actualmente, las pruebas de diagnóstico usadas en la práctica clínica son de analito único, y por tanto no capturan el valor potencial de conocer las relaciones entre docenas de diferentes marcadores. Además, las pruebas de diagnóstico frecuentemente son no cuantitativas, basándose en inmunohistoquímica. Este método produce a menudo diferentes resultados en diferentes laboratorios, en parte porque los reactivos no están normalizados, y en parte porque las interpretaciones son subjetivas y no pueden cuantificarse fácilmente. Las pruebas basadas en ARN no se han usado a menudo debido al problema de la degradación del ARN a lo largo del tiempo y el hecho de que es difícil obtener muestras de tejido recientes de los pacientes para el análisis. Está más fácilmente disponible tejido incrustado en parafina fijado y se han establecido métodos para detectar ARN en tejido fijado. Sin embargo, estos métodos normalmente no permiten el estudio de grandes números de genes (ADN o ARN) a partir de pequeñas cantidades de material. Por tanto, pocas veces se ha usado tejido fijado de manera tradicional para otras cosas que para la detección inmunohistoquímica de proteínas.

Recientemente, varios grupos han publicado estudios referentes a la clasificación de diversos tipos de cáncer mediante análisis de la expresión génica con microalineamientos (véanse, por ejemplo Golub et al., Science 286:531-537 (1999) ; Bhattacharjae et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 98:13790-13795 (2001) ; Chen-Hsiang et al., Bioinformatics 17 (supl. 1) :S316-S322 (2001) ; Ramaswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:15149-15154 (2001) ) . También se han notificado ciertas clasificaciones de cánceres de mama humanos basándose en los patrones de expresión génica (Martin et al., Cancer Res. 60:2232-2238 (2000) ; West et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 98:11462-11467 (2001) ; Sorlie et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 98:10869-10874 (2001) ; Yan et al., Cancer Res. 61:8375-8380 (2001) ) . Sin embargo, estos estudios se centran en su mayor parte en mejorar y refinar la clasificación ya establecida de diversos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama, y generalmente no proporcionan nuevas percepciones en las relaciones de los genes expresados de manera diferencial, y no vinculan los hallazgos a estrategias de tratamiento con el fin de mejorar el desenlace clínico de la terapia contra el cáncer.

Aunque la moderna bioquímica y biología molecular han revelado más de 100 genes cuyas actividades influyen en el comportamiento de células tumorales, el estado de su diferenciación y su sensibilidad o resistencia a ciertos fármacos terapéuticos, con unas pocas excepciones, el estado de estos genes no se ha aprovechado para el fin de 45 tomar decisiones clínicas de manera rutinaria sobre los tratamientos farmacológicos. Una notable excepción es el uso de la expresión de la proteína de receptor de estrógenos (RE) en carcinomas de mama para seleccionar pacientes a tratamiento con fármacos antiestrógenos, tales como tamoxifeno. Otro ejemplo excepcional es el uso de la expresión de la proteína ErbB2 (Her2) en carcinomas de mama para seleccionar pacientes con el fármaco antagonista de Her2 Herceptin® (Genentech, Inc., South San Francisco, CA) .

A pesar de los recientes avances, el desafío del tratamiento contra el cáncer sigue siendo dirigir regímenes de tratamiento específicos a tipos de tumores patogénicamente distintos, y en última instancia personalizar el tratamiento tumoral con el fin de maximizar el desenlace. Por tanto, existe una necesidad de pruebas que proporcionan simultáneamente información predictiva sobre las respuestas de los pacientes a la variedad de 55 opciones de tratamiento. Esto es particularmente cierto para cáncer de mama, cuya biología se entiende mal. Está claro que la clasificación del cáncer de mama en unos cuantos subgrupos, tales como el subgrupo ErbB2+ y los subgrupos caracterizados por expresión génica de baja a ausente del receptor de estrógenos (RE) y unos cuantos factores de transcripción adicionales (Perou et al., Nature 406:747-752 (2000) ) no se refleja en la heterogeneidad celular y molecular del cáncer de mama, y no permite el diseño de estrategias de tratamiento que maximicen la respuesta del paciente El documento WO 02/10436 da a conocer un método de pronóstico de cáncer de mama basado en determinar el nivel de expresión de transcritos de ARN específicos. Se ensaya la expresión SURV, pero no se encuentra que esté asociada.

VAN ’T VEER ET AL, 2002 ("Gene Expression Profiling Predicts Clinical Outcome of Breast Cancer", NATURE, vol.

415, nº 6871, páginas 530-536) da a conocer perfiles de expresión de ARNm asociados con un mal desenlace en cánceres de mama. La tabla 2 complementaria enumera 231 genes indicadores de pronóstico, incluyendo BIRC5/SURV. Sin embargo, SURV no se selecciona para la firma de pronóstico de 70 genes.

Sumario de la invención Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de un paciente con cáncer de mama sin recidiva de cáncer de mama, tras la extirpación quirúrgica del tumor primario tal como se especifica en la reivindicación 1.

La presente invención adapta el uso de material de biopsia incrustado en parafina archivado para el ensayo de todos los marcadores en el conjunto, y por tanto es compatible con el tipo de material de biopsia más ampliamente disponible.

El aislamiento del ARN a partir de una muestra de tejido de cáncer de mama incrustado en cera, fijado del paciente puede llevarse a cabo, por ejemplo, siguiendo cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente o a lo largo de la solicitud, o mediante cualquier otro método conocido en la técnica.

Breve descripción de los dibujos La figura 1 es un gráfico que ilustra el flujo de trabajo del procedimiento de la invención para la medición de la expresión génica. En la figura, FPET significa “tejido incrustado en parafina fijado” y “RT-PCR” significa “PCR con transcriptasa inversa”. Se determina la concentración de ARN usando el protocolo y reactivo de cuantificación de ARN RiboGreen™ comercial.

La figura 2 es un diagrama de flujo que muestra las etapas de un método de extracción de ARN según la invención junto a un diagrama de flujo de un método comercial representativo.

La figura 3 es un esquema que ilustra las etapas de un método mejorado para preparar ARNm fragmentado para el 30 análisis de obtención del perfil de expresión.

La figura 4 ilustra métodos para la amplificación de ARN antes de la RT-PCR.

La figura 5 ilustra un esquema alternativo para la reparación y amplificación de ARNm fragmentado.

La figura 6 muestra la medición de los niveles de ARNm del receptor de estrógenos en 40 muestras de cáncer de mama FPE mediante RT-PCR. Se usaron tres secciones de 10 micrómetros para cada medición. Cada punto de datos representa el promedio de mediciones por triplicado.

La figura 7 muestra los resultados de la medición de los niveles de ARNm del receptor de progesterona en 40 muestras de cáncer de mama FPE mediante RT-PCR realizada tal como se describe en la leyenda de la figura 6 anterior.

La figura 8 muestra resultados de un experimento de IVT/RT-PCR.

La figura 9 es una representación de la expresión de 92 genes a través de 70 muestras de cáncer de mama FPE. El eje y muestra la expresión como tiempos de ciclo umbral. Estos genes son un subconjunto de los genes enumerados en la tabla 1.

La... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de un paciente con cáncer de mama sin la recidiva de cáncer de mama, tras la extirpación quirúrgica del tumor primario, que comprende determinar mediante RT-PCR el nivel del transcrito de ARN de SURV en una muestra de tejido de cáncer de mama incrustado en cera, fijado obtenida de dicho paciente, normalizado frente al nivel de todos los transcritos de ARN sometidos a ensayo en dicha muestra, o un conjunto de referencia de transcritos de ARN,

en el que un aumento del nivel normalizado del transcrito de ARN de SURV en comparación con el nivel normalizado del transcrito de ARN de SURV en un conjunto de referencia de tejidos de cáncer de mama indica una reducción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo sin recidiva de cáncer de mama.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el cáncer de mama es cáncer de mama invasivo.

3. Método según la reivindicación 2, en el que el cáncer de mama invasivo es carcinoma ductal invasivo o carcinoma lobular invasivo.

4. Método según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el conjunto de referencia de tejido de cáncer de mama consiste en al menos aproximadamente 30 muestras distintas fijadas de tejido de cáncer de mama incrustadas en parafina.

5. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el conjunto de referencia de tejido de cáncer de mama consiste en al menos aproximadamente 40 muestras distintas fijadas de tejido de cáncer de mama incrustadas en parafina.


 

Patentes similares o relacionadas:

Procedimiento de oxidación biocatalítico con producto génico alkL, del 20 de Febrero de 2019, de EVONIK DEGUSSA GMBH: Procedimiento para la oxidación de una sustancia orgánica utilizando al menos una enzima oxidativa y al menos un producto génico alkL, caracterizado porque el producto […]

Método de producción de alérgenos recombinantes de alta calidad en una planta, del 19 de Febrero de 2019, de Angany Inc: Procedimiento de producción de un alérgeno recombinante en una planta de tabaco Nicotiana benthamiana, que comprende las siguientes etapas: a) el cultivo de la planta […]

Preparación de anticuerpos que tienen una ADCC a través del CD16, en particular de los anticuerpos monoclonales anti-Rhesus D, del 13 de Febrero de 2019, de LABORATOIRE FRANCAIS DU FRACTIONNEMENT ET DES BIOTECHNOLOGIES: Procedimiento de preparación de un anticuerpo monoclonal capaz de activar las células efectoras que expresan el FcgammaRIII, caracterizado […]

Línea altamente productora de fibrinógeno recombinante y método para su producción, del 6 de Febrero de 2019, de Japan Blood Products Organization: Una línea celular recombinante altamente productora de fibrinógeno, que es una línea celular animal que expresa conjuntamente fibrinógeno y α2PI y/o PAI-2 obtenida […]

Método de reprogramación nuclear, del 6 de Febrero de 2019, de KYOTO UNIVERSITY: Un método para producir una célula madre pluripotencial inducida, que comprende la etapa de introducir dos o más tipos de vectores de expresión […]

Anticuerpos anti-fractalcina humana mejorados y sus usos, del 4 de Febrero de 2019, de EISAI R&D MANAGEMENT CO., LTD: Un anticuerpo anti-fractalcina o fragmento de unión a fractalcina del mismo, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a fractalcina del […]

Promotor y procedimiento para la transformación de microorganismos Traustoquitriales, del 4 de Febrero de 2019, de DSM IP ASSETS B.V.: Molécula aislada de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en: a. SEC ID nº 4; […]

Bacteriocina derivada de lactobacillus rhamnosus, del 4 de Febrero de 2019, de Hiroshima University: Un péptido antimicrobiano básico que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 o en la SEQ ID NO: 2 en el LISTADO DE SECUENCIAS o con la misma […]

Otras patentes de GENOMIC HEALTH, INC.