Procedimiento de obtención de extractos enzimáticos con actividad farmacológica a partir de orujo de uva.

El objeto de la invención es el desarrollo de un nuevo proceso biológico de extracción que conduzca a la obtención de un extracto con actividad farmacológica a partir de orujo de uva.

El proceso conduce a la obtención de un nuevo producto de origen natural totalmente soluble y con capacidad vasodilatora, el cual tiene características como alimento funcional o nutracéutico para la prevención y/o tratamiento de ciertas patologías cardiovasculares.

Procedimiento de obtención de extractos enzimáticos con actividad farmacológica a partir de orujo de uva

Objeto de la invención

La presente invención tiene por objeto el desarrollo de un nuevo sistema de extracción de los compuestos funcionales contenidos en el orujo de uva, la obtención de un extracto enzimático de orujo de uva (EE-OU) y su aplicación farmacológica en la terapéutica como agente vasodilatador, así como la dilucidación del mecanismo de acción de dicho efecto, centrando nuestra atención en los factores derivados del endotelio que participan en el posible efecto vasodilatador.

La actividad farmacológica del extracto en el sistema vascular podría ser la base para proponer su uso como alimento funcional o nutracéutico para la prevención y/o tratamiento de ciertas patologías cardiovasculares.

Estado de la técnica

El orujo de uva es un residuo industrial del proceso de vinificación y que se compone básicamente de las semillas, piel y tallos de la uva. Este subproducto contiene una cantidad considerable de polifenoles bioactivos. Esta composición proporciona al orujo de uva de un prometedor potencial como alimento funcional o nutracéutico.

La evaluación cualitativa del total de compuestos fenólicos como equivalentes de ácido gálico (GAE), muestra la piel de la uva como la principal fuente de estos compuestos, seguido de la semilla y la hoja (Xia et al., 2010). Las antocianinas, catequinas, flavonoides, ácidos fenólicos, alcoholes y estilbenos, así como el resveratrol, son algunos de los polifenoles presentes en el orujo de uva. Por lo tanto, este residuo de uva se convierte en una fuente de gran potencial de productos biológicos.

Numerosos estudios epidemiológicos apoyan las propiedades beneficiosas de los compuestos fenólicos de la uva y del vino tinto, especialmente en las enfermedades cardiovasculares a través de sus acciones antioxidante, vasodilatadora y antiagregante plaquetaria (Stoclet et al., 2004). En los últimos años, se ha centrado la atención en los efectos positivos de los extractos de semilla de uva (Edirisinghe et al, 2008) y de la piel (Madeira et al, 2009) en la función vascular de arterias aisladas. Los extractos de semilla también han demostrado propiedades antiangiogénicas en las células endoteliales (Agarwal et al, 2004; Lu et al, 2009), así como protección contra la formación de aterosclerosis (Vinson et al, 2002). Además, se ha comprobado que la ingesta de un extracto de semilla de uva mejora la función vascular en seres humanos

con un riesgo cardiovascular superior a la media (Clifton et al, 2004) y en sujetos de alto riesgo cardiovascular con diabetes mellitus tipo 2 (Kar et al, 2009).

Se han patentado diversos procedimientos conducentes a la extracción de dichos compuestos relacionados con la invención propuesta, que a su vez son muy afines entre ellos.

Grape extract, dietary supplement thereof, and processes therefor: US

2007/0071871A1 (Shrikhande A.J. et al., 2007) y US 20100297741A1 (Shrikhande A.J. et al., 2010), en los cuales se describe el proceso de elaboración y caracterización de un extracto acuoso de semilla de uva, así como su efecto sobre la presión arterial y niveles de LDL oxidada en individuos (hombres y mujeres) con pre-hipertensión o síndrome metabólico. El extracto es preparado según un proceso de extracción donde primero es procesado con agua caliente (según la patente US 6544581 y ligeramente modificado), para posteriormente sufrir un tratamiento enzimático con una enzima pectolítica (Pectinex®Ultra SP-L). El extracto es administrado a los pacientes como suplemento dietético a dosis de 150 y 300 mg/dia, que se encuentra manufacturado como Mega Natural®-BP.

Los otros dos documentos describen prácticamente lo mismo, pero sin describir el proceso de extracción y caracterización:

Method for lowering blood pressure in pre-hypertensive individuáis and/or individuáis with metabolic syndrome: US 2007/0071841A1 (Kappagoda Ch.T., 2007) y US 7651707B2 (Kappagoda Ch.T., 2010).

En la presente invención se ha innovado y se ha desarrollado un nuevo proceso de invención mediante un método de extracción enzimática el cual da lugar a un nuevo extracto del orujo de uva soluble en agua (EE-OU), que proporciona una gran cantidad de compuestos fenólicos, entre otros componentes. El proceso de extracción biológica realizado por las enzimas hidrolíticas tiene ciertas ventajas, ya que al utilizarse bajas temperaturas y presiones se ve favorecida la estabilidad de los ingredientes activos. También hay que tener en cuenta, que protege el medioambiente, ya que el método de extracción enzimática excluye el uso de xenobióticos o tóxicos reactivos.

Uno de los mecanismos más importantes por los cuales los productos derivados de uva provocan las acciones descritas a nivel vascular, es mediante el aumento de la producción por las células endoteliales del factor vasodilatador y antiagregante plaquetario, el óxido nítrico (NO). Por lo tanto, el NO está implicado en los efectos vasodilatadores in vitro de los compuestos polifenólicos del vino tinto (Fitzpatrick et al, 1993; Andriambeloson et al, 1997; Andriambeloson et la de 1999; Duarte et al, 2004),

de los extractos de semilla de uva (Fitzpatrick et al, 2000;. Fitzpatrick et al, 2002; Edirisinghe et al, 2008) así como de la piel (Madeira et al, 2009)..

En cuanto a los extractos de orujo de uva en su totalidad, no existen estudios sobre sus efectos vasculares hasta ahora. Las investigaciones existentes se limitan a las propiedades antioxidantes (Chidambara et al, 2002) y antiinflamatorias asociadas al estado inflamatorio presente en la obesidad y resistencia a la insulina (Yunoki et al, 2008; Hogan et al, 2010)

Las invenciones antes citadas demuestran que el extracto administrado con Mega Natural®-BP diariamente durante 4 semanas a las dosis de 150 mg y 300 mg, es capaz de reducir tanto la presión arterial sistólica como diastólica en individuos con síndrome metabólico. Cuando los ensayos son realizados en individuos prehipertensos, es la dosis de 300mg de extracto, administrada durante 8 semanas la que provoca una reducción significativa de la presión sistólica y diastólica.

Pero en estas invenciones, en ningún momento relaciona este efecto con ninguna acción directa reconocida de carácter vasodilatador que es la presentada en nuestra invención. Es por lo que se propone en la invención propuesta, el estudio "¡n vitro" del extracto que presentamos y que nos permitirá también conocer el mecanismo de acción posible de dicho efecto.

El objetivo del presente estudio fue evaluar los posibles efectos vasculares en aorta y arterias mesentéricas aisladas de rata de un extracto de orujo de uva, obtenido a través de un proceso enzimático. Además, es también intención dilucidar los factores derivados del endotelio que participan en el posible efecto vasodilatador inducido por el extracto, centrando nuestra atención en la participación de NO y la capacidad antioxidante.

Descripción de las figuras

Figura 1: Curvas concentración-respuesta de relajación inducidas por EE-OU en anillos de aorta aislada ratas Wistar precontraidos con fenilefrina (0,3 pM) con endotelio (E+) o sin endotelio funcional (E-), y en presencia del inhibidor de la NO- sintasa, L-NAME (300pM). *** P < 0.001 vs E(+) (2-way ANOVA)

Figura 2: Curvas concentración-respuesta de relajación inducidas por EE-OU en segmentos de arterias mesentéricas de menor calibre aislada de ratas Wistar precontraidas con fenilefrina (10 pM) con endotelio (E+) o sin endotelio funcional (E-), y en presencia del inhibidor de la NO-sintasa, L-NAME (300pM). *** P < 0.001 vs E(+) (2-way ANOVA).

Figura 3: Trazado original del efecto relajante de dosis acumulativas de EE-OU (0,0001 a 0,3 g L'1) sobre anillos de aorta aislada de rata con endotello funcional precontraidos con fenilefrina (0,3 pM).

Figura 4: Trazado original del efecto relajante de dosis acumulativas de EE-OU (0,0001 a 0,3 g L'1) sobre segmentos de arteris mesentéricas con endotelio funcional precontraidos con fenilefrina (10 pM).

Descripción de la invención

1. Proceso de obtención del extracto.

Proceso de hidrólisis enzimática.

Los extractos enzimáticos se obtienen mediante la ruptura de los enlaces peptídicos de unión de aminoácidos que forman las proteínas, produciendo péptidos y, eventualmente, aminoácidos mediante el uso de enzimas proteolíticas.

A continuación se describe el proceso de obtención:

1. El orujo de uva es homogenizado mediante un sistema de molienda, hasta obtener un producto en forma de polvo.

2. El orujo pulverizado es resuspendido en agua, la proporción... [Seguir leyendo]

1- Procedimiento de obtención de extractos enzimáticos con actividad farmacológica a partir de orujo de uva, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) Molienda y homogenización de los orujos de uva

b) Obtener mediante la adición de agua una suspensión entre 10-25% de materia seca y ajustar el pH al óptimo de la enzima proteolítica.Añadir una base concentrada para ajustar el pH de los mismos;

c) Someter la mezcla obtenida en (b) a una hidrólisis enzimática, mediante el uso de enzimas hidrolíticas para obtener un extracto enzimático orgánico. Las enzimas hidróliticas a utilizar serán proteasas, específicamente endoproteasas, entre ellas se encuentran las proteasas alcalinas, y neutras producidas por Bacillus, las proteasas ácidas (pepsina, papaína) etc.

d) Un ejemplo de este proceso es la Hidrólisis enzimática utilizando proteasas alcalinas, caracterizado por concentraciones de enzima utilizadas entre el 0,1-0.5%, el rango de temperatura usado entre 40-70°C, rango de pH 8-10 y tiempo de operación entre 2 y 48 horas

2 - Procedimiento de obtención de extractos enzimáticos con actividad farmacológica a partir de orujo de uva, según reivindicación 1, caracterizado porque comprende una etapa posterior a la etapa (d) en la que el extracto enzimático orgánico obtenido se somete a concentración para obtener un extracto enzimático orgánico concentrado con al menos un 40% en peso de materia seca.

3- Procedimiento de obtención de extractos enzimáticos con actividad farmacológica a partir de orujo de uva, según reivindicación 1, que comprende una etapa posterior a la concentración (reivindicación 5) en la que el extracto enzimático orgánico obtenido se somete a liofilización para obtener un extracto enzimático orgánico en forma de polvo.

4- Procedimiento de obtención de extractos enzimáticos con actividad farmacológica a partir de orujo de uva, según reivindicaciones anteriores, caracterizado por el uso del extracto debido al efecto vasodilatador para ser utilizado en la prevención y/o tratamiento de ciertas patologías cardiovasculares.