Mutantes de alfa-amilasa.
Variante de una α-amilasa de tipo Termamyl progenitora, cuya variante tiene actividad de α
-amilasa y muestra estabilidad mejorada a pH 8 hasta 10,5 en relación con la alfa amilasa progenitora. Dicha variante comprende solo una mutación de la α-amilasa de tipo Termamyl progenitora, donde la única mutación del progenitor es una de las siguientes sustituciones; G149Y,S,K,A,T,C,F,H,W,V (usando la SEQ ID NO: numeración 6) y donde la α-amilasa tipo Termamyl progenitora tiene al menos 95 % de homología con la SEQ ID NO: 6.
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10180200.
Solicitante: NOVOZYMES A/S.
Nacionalidad solicitante: Dinamarca.
Dirección: Krogshøjvej 36 2880 Bagsvaerd DINAMARCA.
Inventor/es: NISSEN, TORBEN, LAUESGAARD, SVENDSEN, ALLAN, BORCHERT, TORBEN VEDEL, ANDERSEN, CARSTEN, NIELSEN,BJARNE RØNFELDT, KJÆRULFF,SØREN.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K14/32 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Bacillus (G).
- C11D3/386 C […] › C11 ACEITES, GRASAS, MATERIAS GRASAS O CERAS ANIMALES O VEGETALES; SUS ACIDOS GRASOS; DETERGENTES; VELAS. › C11D COMPOSICIONES DETERGENTES; UTILIZACION DE UNA SOLA SUSTANCIA COMO DETERGENTE; JABON O SU FABRICACION; JABONES DE RESINA; RECUPERACION DE LA GLICERINA. › C11D 3/00 Otros compuestos que entran en las composiciones detergentes cubiertas por C11D 1/00. › Preparaciones que contienen enzimas.
- C12N1/21 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
- C12N15/09 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
- C12N9/28 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › alfa-amilasa de origen microbiano, p. ej. amilasa bacteriana.
- C12R1/10 C12 […] › C12R SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C - C12Q, RELATIVO A LOS MICROORGANISMOS. › C12R 1/00 Microorganismos. › Bacillus licheniformis.
PDF original: ES-2515218_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Mutantes de α-amilasa
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a variantes (mutantes) de α-amilasas tipo Termamyl progenitora con actividad más alta a temperaturas medias y/o pH alto.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las α-amilasas (α-1, 4-glucan-4-glucanohidrolasas, EC 3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de almidón y otros oligo y polisacáridos 1.4-glucosídicos lineales y ramificados.
Hay un cuerpo muy extenso de patentes y bibliografía científica acerca de esta clase de enzimas muy importantes a nivel industrial. Un número de α-amilasas como las variantes (mutantes) de α-amilasas tipo Termamyl se conocen a partir de, por ejemplo, WO 90/11352 , WO 95/10603 , WO 95/26397 , WO 96/23873 y WO 96/23874. Particularmente, WO 95/10603 divulga una variante de B.licheniformis o una amilasa que tiene un 60% de homología con esta y con una modificación en al menos uno de los residuos de aminoácidos localizados en la región 142-182, en particular una eliminación de todos los residuos de aminoácidos en la dicha región, o una parte sustancial de los mismos.
Entre descripciones más recientes acerca de las α-amilasas, WO 96/23874 proporciona datos de estructuras cristalinas tridimensionales en rayos X para una α-amilasa de tipo Termamyl que consiste del 300 residuos de aminoácidos de N-terminal de la α-amilasa B. amyloliquefaciens (BAN™) y los aminoácidos 301-483 del extremo Cterminal de la α-amilasa B. licheniformis que comprende la secuencia de aminoácidos (estando este último disponible comercialmente con el nombre comercial Termamyl™) , y que está así cercanamente relacionada con las α-amilasas de Bacillus industrialmente importantes (que en el presente contexto están incluidas dentro del significado del término "α-amilasas tipo Termamyl", y que incluyen, entre otras cosas, las α-amilasas de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens (BAN™) y B. stearothermophilus (BSG™) ) . WO 96/23874 también describe la metodología para diseñar, sobre la base de un análisis de la estructura de una α-amilasa progenitora tipo Termamyl, variantes de la α-amilasa progenitora tipo Termamyl que presentan propiedades alteradas con respecto a la progenitora.
DIVULGACIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a nuevas variantes α-amilolíticas (mutantes) de una α-amilasa tipo Termamyl, en particular variantes que exhiben mejor rendimiento de lavado (en relación a la α-amilasa progenitora) con pH alto y a temperatura media.
El término "temperatura media" significa, en el contexto de la invención, una temperatura de 10º C a 60º C, preferiblemente 20º C a 50º C, especialmente 30-40º C.
El término "pH alto" significa que el pH alcalino que hoy se usa para lavar, más específicamente de aproximadamente pH 8 a 10, 5.
En el contexto de la invención una "α-amilasa de baja temperatura" significa una α-amilasa que tiene una actividad óptima relativa en el rango de temperatura de 0 a 30 º C.
En el contexto de la invención "α-amilasa de temperatura media" significa una α-amilasa que tiene una actividad óptima en el rango de temperatura de 30 a 60º C. Por ejemplo, las α-amilasas SP690 y SP722, respectivamente, son "α-amilasas de temperatura media".
En el contexto de la invención de una "α-amilasa de alta temperatura" es una α-amilasa con la actividad óptima en el rango de temperatura de 60 a 110º C. Por ejemplo, Termamyl es una "α-amilasa de alta temperatura".
Las alteraciones en las propiedades que se pueden conseguir en las variantes (mutantes) de la invención son alteraciones en:
La estabilidad de la α-amilasa de tipo Termamyl a un pH de 8 a 10, 5, y/o la estabilidad de Ca2+ a pH 8 a 10.5, y/o la actividad específica a temperaturas de 10 a 60º C, preferiblemente de 20 a 50º C, especialmente de 30 a 40º C.
Debe observarse que la temperatura relativa óptima frecuentemente depende del pH específico usado. En otras palabras, la temperatura relativa óptima determinada a, por ejemplo pH 8, puede ser sustancialmente diferente de la temperatura relativa óptima determinada a, por ejemplo, pH 10.
La influencia de la temperatura en la actividad enzimática [0013] La dinámica en el sitio activo y el medio ambiente dependen de la temperatura y la composición de aminoácido y de la marcada importancia para la temperatura relativa óptima de una enzima. Al comparar la dinámica de las α-amilasas de temperatura media y alta, pueden determinarse las regiones de importancia para la función de las α-amilasas de temperatura alta a temperaturas medias. El perfil de actividad de temperatura de la α-amilasa SP722 (SEQ ID NO: 2) y la α-amilasa de B. licheniformis (disponible de Novo Nordisk como Termamyl®) (SEQ ID NO: 4) se muestran en la Figura 2.
La temperatura relativa óptima de SP722 en actividades absolutas demuestra ser más alta a temperaturas de rango medio (30 a 60º C) que la α-amilasa de B. licheniformis, que tiene una actividad óptima a alrededor de 60 a 100º C. Los perfiles dependen principalmente de la estabilidad de la temperatura y la dinámica de los residuos de sitio activo y su medio ambiente. Además, los perfiles de la actividad dependen del pH usado y el pKa de los residuos de sitio activo.
En el primer aspecto la invención se refiere a una variante de una α-amilasa de tipo Termamyl progenitora, cuya variante tiene actividad de α-amilasa y muestra estabilidad mejorada a pH 8 a 10, 5 en relación con la alfa amilasa progenitora. Dicha variante comprende solo una mutación de la α-amilasa de tipo Termamyl progenitora, donde la única mutación del progenitor es una de las siguientes sustituciones; G149Y, S, K, A, T, C, F, H, W, V (utilizando la SEQ ID NO: numeración 6) y donde la α-amilasa tipo Termamyl progenitora tiene al menos 95% de homología con la SEQ ID NO: 6.
Las variantes de la invención mencionadas arriba muestran una alteración en al menos una de las siguientes propiedades relativas a la α-amilasa progenitora:
i) mejor estabilidad de pH con un pH de 8 a 10, 5; y/o ii) mejor estabilidad de Ca2+ con pH 8 a 10, 5, y/o iii) actividad específica aumentada a temperaturas de 10 a 60 º C,
preferiblemente 20 a 50º C, especialmente 30 a 40º C. Además, se describirán detalles más abajo.
La invención además se refiere a constructos de ADN que codifican las variantes de la invención y al uso de variantes de la invención, solas o en combinación con otras enzimas, en diferentes productos o procesos industriales, por ejemplo, en detergentes o para licuefacción de almidón.
Nomenclatura [0018] En la presente descripción y reivindicaciones, se usan los códigos los códigos de una y tres letras convencionales para residuos de aminoácidos.
Para facilidad de referencia, las variantes de α-amilasa de la invención están descritas usando la siguiente nomenclatura:
Aminoácido (s) original (es) : posición (es) :aminoácido (s) substituido (s) [0020] Según esta nomenclatura, y a modo de ejemplo, la sustitución de alanina por asparraguina en la posición 30 50 está mostrada como:
Ala30Asn o A30N una eliminación de alanina en la misma posición está mostrada como: Ala30* o A30*
y la inserción de un residuo de aminoácido adicional, tal como lisina, está mostrada como: Ala30AlaLys o A30AK
Una eliminación de una extensión consecutiva de residuos de aminoácidos, ejemplificados por los residuos de aminoácidos 30-33, está indicada como (30-33) * o Δ (A30-N33) .
Donde una α-amilasa específica contiene una “eliminación” en comparación con otras α-amilasas y se hace una inserción en tal posición, esto se indica como:
*36Asp o *36D 65 para la inserción de un ácido aspártico en la posición 36.
Las mutaciones múltiples están separadas por signos de más, es decir:
Ala30Asp + Glu34Ser o A30N+E34S
representando mutaciones en las posiciones 30 y 34 sustituyendo la alanina y el ácido glutámico por asparagina y serina, respectivamente.
Cuando uno o más residuos de aminoácidos alternativos se pueden insertar en una posición dada, se indican como A30N, E o A30N o A30E
Además, cuando una posición adecuada para la modificación está identificada en la presente sin ninguna modificación específica sugerida, debe entenderse que cualquier otro residuo de aminoácido puede ser sustituido por el residuo de... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Variante de una α-amilasa de tipo Termamyl progenitora, cuya variante tiene actividad de α-amilasa y muestra estabilidad mejorada a pH 8 hasta 10, 5 en relación con la alfa amilasa progenitora. Dicha variante comprende solo una mutación de la α-amilasa de tipo Termamyl progenitora, donde la única mutación del progenitor es una de las siguientes sustituciones; G149Y, S, K, A, T, C, F, H, W, V (usando la SEQ ID NO: numeración 6) y donde la α-amilasa tipo Termamyl progenitora tiene al menos 95 % de homología con la SEQ ID NO: 6.
2. Variante según la reivindicación 1, cuya variante tiene una de las siguientes sustituciones: G149A, K, S, Y
3. Uso de una variante de α-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para lavado y/o lavado de la vajilla.
4. Aditivo de detergente que incluye una variante de α-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
5. Aditivo de detergente según la reivindicación 4 que contiene 0, 02-200 mg de enzima proteína/g del aditivo.
6. Aditivo de detergente según la reivindicación 4 o 5, que adicionalmente comprende otra enzima.
7. Composición de detergente que incluye una variante de α-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
8. Composición de detergente según la reivindicación 7 que adicionalmente comprende otra enzima.
9. Composición de detergente según la reivindicación 8 donde la enzima adicional es una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o una celulasa.
10. Composición de detergente de lavado de la vajilla manual o automático que incluye una variante de α-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
11. Composición de detergente de lavado de la vajilla según la reivindicación 10 que adicionalmente comprende otra enzima.
12. Composición de detergente de lavado de la vajilla según la reivindicación 11 donde la enzima adicional es una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o una celulasa.
13. Composición de detergente de lavado de ropa manual o automático que incluye una variante de α-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
14. Composición de lavado de ropa según la reivindicación 13, que adicionalmente comprende otra enzima.
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