Moléculas de unión que pueden neutralizar el virus de la rabia y usos de las mismas.

Composición farmacéutica que comprende al menos dos moléculas de unión que neutralizan el virus de la rabia que pueden reaccionar con epítopos diferentes,

no competitivos del virus de la rabia, en la que una primera molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia puede reaccionar con un epítopo que comprende los aminoácidos 226-231 de la proteína G del virus de la rabia y una segunda molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia puede reaccionar con un epítopo ubicado en el sitio antigénico III que comprende los aminoácidos 330-338 de la proteína G del virus de la rabia

Moléculas de unión que pueden neutralizar el virus de la rabia y usos de las mismas Campo de la invención La invención se refiere a la medicina. En particular, la invención se refiere a moléculas de unión que neutralizan el 5 virus de la rabia. Las moléculas de unión son útiles en la profilaxis tras la exposición de la rabia.

Antecedentes de la invención La rabia es una infección viral con distribución casi mundial que afecta principalmente a animales salvajes y domésticos pero que también implica a seres humanos, dando como resultado una encefalitis devastadora, letal de manera casi invariable. Anualmente, se estiman más de 70.000 víctimas mortales humanas, y millones de otras personas requieren tratamiento tras la exposición.

El virus de la rabia es un virus de ARN monocatenario, con envuelta, con forma de bala, clasificado en la familia de los Rhabdovirus y del género Lyssavirus. El genoma del virus de la rabia codifica para cinco proteínas virales: ARN polimerasa dependiente de ARN (L) ; una nucleoproteína (N) ; una proteína fosforilada (P) ; una proteína de matriz (M) ubicada en el lado interno de la envuelta proteica viral; y una glicoproteína de superficie externa (G) .

La proteína G (62-67 KDa) es una glicoproteína de tipo I compuesta por 505 aminoácidos que tiene de dos a cuatro posibles sitios de N-glicosilación, de los cuales solamente uno o dos se glicosilan dependiendo de las cepas del virus. La proteína G forma los salientes que cubren la superficie externa de la envuelta del virión y se sabe que induce anticuerpos que neutralizan el virus.

La rabia puede tratarse o prevenirse mediante inmunizaciones tanto pasivas como activas. La profilaxis tras la exposición a la rabia incluye el cuidado inmediato de la herida local y la administración de inmunizaciones tanto pasivas (inmunoglobulinas anti-rabia) como activas (vacunas) .

Actualmente, las inmunoglobulinas anti-rabia (RIG) se preparan a partir de las muestras de suero de o bien seres humanos inmunizados contra el virus de la rabia (HRIG) o bien caballos inmunizados contra el virus de la rabia (ERIG) . Una desventaja de ERIG así como de HRIG es que no están disponibles en cantidades suficientes y, en el 25 caso de HRIG, es demasiado cara. Además, el uso de ERIG puede conducir a reacciones adversas tales como choque anafiláctico. La posibilidad de contaminación por patógenos conocidos o desconocidos es un problema adicional asociado con HRIG. Para superar estas desventajas se ha sugerido usar anticuerpos monoclonales que pueden neutralizar el virus de la rabia en profilaxis tras la exposición. Los anticuerpos monoclonales murinos que neutralizan el virus de la rabia se conocen en la técnica (véase Schumacher et al., 1989) . Sin embargo, el uso de anticuerpos murinos in vivo está limitado debido a problemas asociados con la administración de anticuerpos murinos a seres humanos, tales como vida media en suero corta, una incapacidad para provocar ciertas funciones efectoras humanas y producción de una respuesta inmunitaria drástica no deseada contra el anticuerpo murino en un ser humano (la reacción de “anticuerpo humano anti-ratón” (HAMA) ) .

Recientemente, se han descrito anticuerpos monoclonales humanos que neutralizan el virus de la rabia (véase Dietzschold et al., 1990, Champion et al., 2000, y Hanlon et al., 2001) . Para que los anticuerpos monoclonales humanos anti-rabia sean tan eficaces como HRIG en la profilaxis tras la exposición debe usarse una mezcla de anticuerpos monoclonales. En una mezcla de este tipo cada anticuerpo debe unirse a un epítopo o sitio diferente en el virus para prevenir el escape de variantes resistentes del virus.

Actualmente, todavía existe una necesidad significativa de nuevos anticuerpos monoclonales humanos que neutralizan el virus de la rabia que tengan potencial profiláctico tras la exposición mejorado, particularmente anticuerpos que tengan diferentes especificidades de reconocimiento de epítopo. La presente invención proporciona tales anticuerpos monoclonales humanos que ofrecen la posibilidad de usarse en mezclas útiles en la profilaxis tras la exposición de una amplia variedad de virus de la rabia y variantes resistentes a la neutralización de los mismos.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos de la cepa CVS-11 del virus de la rabia y los virus de escape E57. Se recogieron células infectadas por el virus 2 días tras la infección y se aisló el ARN total. Se generó ADNc y se usó para la secuenciación del ADN. Se muestran las regiones que contienen mutaciones y las mutaciones se indican en negrita. La figura 1A muestra la comparación de las secuencias de nucleótidos. Los números por encima de los aminoácidos indican los números de aminoácidos de la glicoproteína del virus de la rabia 50 incluyendo el péptido señal. La figura 1B muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos. En la parte superior se muestra la representación esquemática de la glicoproteína del virus de la rabia. El recuadro negro indica el péptido señal, mientras que el recuadro gris indica el dominio transmembrana. Las secuencias en la figura 1 también están representadas por las SEQ ID No: 130-141.

La figura 2 muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos de la cepa CVS-11 del virus de la rabia y los virus de escape EJB. Se recogieron células infectadas por el virus 2 días tras la infección y se aisló el ARN total. Se generó ADNc y se usó para la secuenciación del ADN. Se muestran las regiones que contienen mutaciones y las mutaciones se indican en negrita. La figura 2A muestra la comparación de las secuencias de nucleótidos. Los números por encima de los aminoácidos indican los números de aminoácidos de la glicoproteína del virus de la rabia incluyendo el péptido señal. La figura 2B muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos. En la parte superior se muestra la representación esquemática de la glicoproteína del virus de la rabia. El recuadro negro indica el péptido señal, mientras que el recuadro gris indica el dominio transmembrana. Las secuencias en la figura 2 también están representadas por las SEQ ID No: 142-151.

La figura 3 muestra el vector PDV-C06.

La figura 4 muestra un ELISA de competición de scFv anti-virus de la rabia y anticuerpo biotinilado anti-virus de la rabia denominado CR-57. Las placas de ELISA recubiertas con proteína G purificada del virus de la rabia se incubaron con scFv respectivos antes de la adición de CR-57bio (0, 5 !g/ml) . Posteriormente, se monitorizó la unión de CR-57bio en ausencia y presencia de scFv.

La figura 5 muestra un ELISA de competición de scFv anti-virus de la rabia y anticuerpo anti-virus de la rabia denominado CR-57. Las placas de ELISA recubiertas con proteína G purificada del virus de la rabia se incubaron con CR-57 (1 !g/ml) antes de la adición de scFv en exceso. Posteriormente, se monitorizó la unión de svFv en ausencia y presencia de CR-57.

La figura 6 muestra un ensayo de ELISA de competición de IgG anti-proteína G del virus de la rabia y el anticuerpo anti-virus de la rabia denominado CR-57. Se incubó proteína G (cepa ERA) con IgG no marcadas (mostrado en el

eje X) . Se añadió CR57 biotinilado (CR57bio) y se permitió que se uniera a la proteína G antes de visualización por medio del estreptavidina-HRP. Las señales de ELISA se muestran como porcentaje de unión de CR57bio solo.

La figura 7 muestra un ensayo de FACS de competición de IgG anti-proteína G del virus de la rabia y el anticuerpo anti-virus de la rabia denominado CR-57. Se incubaron células PER.C6 que expresan proteína G (cepa ERA) con IgG no marcadas (mostrado en el eje X) . Se añadió CR57 biotinilado (CR57bio) y se permitió que se uniera a las células que expresan la proteína G antes de visualización por medio de estreptavidina-PE. Las señales de FACS se muestran como porcentaje de unión de CR57bio solo.

La figura 8 muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos de virus de escape E98 y CVS-11. Se recogieron células infectadas por el virus 2 días tras la infección y se aisló el ARN total. Se generó ADNc y se usó para la secuenciación del ADN. Se muestra la región que contiene una mutación puntual y la mutación se indica en negrita. La figura 8A muestra la comparación de las secuencias de nucleótidos. El número por encima del nucleótido indica el nucleótido mutado (indicado en negrita) del marco de lectura abierto de la glicoproteína del virus de la rabia sin secuencia de péptido señal. La figura 8B muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos. El número por encima del aminoácido indica el aminoácido mutado... [Seguir leyendo]

1. Composición farmacéutica que comprende al menos dos moléculas de unión que neutralizan el virus de la rabia que pueden reaccionar con epítopos diferentes, no competitivos del virus de la rabia, en la que una primera molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia puede reaccionar con un epítopo que comprende los aminoácido.

22. 231 de la proteína G del virus de la rabia y una segunda molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia puede reaccionar con un epítopo ubicado en el sitio antigénico III que comprende los aminoácido.

33. 338 de la proteína G del virus de la rabia.

2. Composición farmacéutica que comprende dos moléculas de unión que neutralizan el virus de la rabia que pueden unirse a epítopos diferentes, no competitivos del virus de la rabia, comprendiendo la composición:

una primera molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia que puede unirse a un epítopo que comprende los aminoácido.

22. 231 de la proteína G del virus de la rabia, comprendiendo dicho primer anticuerpo que neutraliza el virus de la rabia:

una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 273, y

una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 275, y

una segunda molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia que puede unirse a un epítopo ubicado en el sitio antigénico III que comprende los aminoácido.

33. 338 de la proteína G del virus de la rabia.

3. Composición farmacéutica según la reivindicación 2, en la que la segunda molécula de unión que neutraliza el virus de la rabia comprende:

una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 29 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 53, o una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 35 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 59, o una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 63, o una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 40 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 64, o una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 41 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 65, o una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 47 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 71.

4. Composición farmacéutica según la reivindicación 2, en la que la primera molécula de unión al virus de la rabia es una IgG y la segunda molécula de unión al virus de la rabia es una IgG.

SeñaldeELISA

FIGURA 7