Moléculas de unión humanas que pueden neutralizar el virus influenza H5N1 y usos de las mismas.

Anticuerpo humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo,

que puede reconocer y unirse a unepítopo en la subunidad HA2 de la proteína hemaglutinina (HA) de influenza, caracterizado porque dicho anticuerpoo fragmento de unión a antígeno del mismo tiene actividad neutralizante contra un virus influenza que comprendeHA del subtipo H5, tal como H5N1, H5N2, H5N8 y H5N9, y porque el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno delmismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende los aminoácidos 1-121 de SEQ ID NO: 65y una región variable de cadena ligera que comprende los aminoácidos 1-112 de SEQ ID NO: 91.

Moléculas de unión humanas que pueden neutralizar el virus influenza H5N1 y usos de las mismas

Campo de la invención La invención se refiere a la medicina. En particular, la invención se refiere al diagnóstico, la profilaxis y/o el tratamiento de una infección por virus influenza H5N1.

Antecedentes de la invención Los virus influenza consisten en tres tipos, A, B y C. Los virus influenza A infectan a una amplia variedad de aves y mamíferos, incluyendo seres humanos, caballos, mamíferos marinos, cerdos, hurones y pollos. En animales la mayoría de los virus influenza A provocan infecciones localizadas leves de las vías respiratorias y el tracto intestinal.

Sin embargo, existen cepas altamente patogénicas de influenza A tales como H5N1 que provocan infecciones sistémicas en aves de corral en las que la mortalidad puede alcanzar el 100%. Los animales infectados con influenza A actúan a menudo como reservorio para los virus influenza y se ha mostrado que ciertos subtipos cruzan la barrera entre especies hacia los seres humanos.

Los virus influenza A pueden clasificarse en subtipos basándose en variaciones alélicas en regiones antigénicas de dos genes que codifican para glicoproteínas de superficie, concretamente, hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) que se requieren para la unión viral y la liberación celular. Otras proteínas virales principales incluyen la nucleoproteína, la proteína estructural de la nucleocápsida, proteínas de membrana (M1 y M2) , polimerasas (PA, PB y PB2) y proteínas no estructurales (NS1 y NS2) .

Actualmente, se conocen dieciséis subtipos de HA (H1-H16) y nueve variantes antigénicas de NA (N1-N9) del virus influenza A. Anteriormente, sólo se conocía que tres subtipos circulaban en seres humanos (H1N1, H1N2 y H3N2) . Sin embargo, en los últimos años, se ha notificado que el subtipo patogénico H5N1 de influenza aviar A cruza la barrera entre especies e infecta a seres humanos, tal como se documentó en Hong Kong en 1997 y 2003, conduciendo a la muerte de varios pacientes.

En seres humanos, el virus influenza aviar infecta a células de las vías respiratorias así como del tracto intestinal, hígado, bazo, riñones y otros órganos. Los síntomas de la infección por influenza aviar incluyen fiebre, dificultades respiratorias incluyendo dificultad para respirar y tos, linfopenia, diarrea y dificultades para regular los niveles de glucemia. A diferencia de la influenza estacional el grupo con más riesgo son los adultos sanos que constituyen el grueso de la población. Debido a la alta patogenicidad de ciertos subtipos de influenza aviar A, particularmente H5N1, y su capacidad demostrada de cruzar para infectar a seres humanos, hay un riesgo económico y de salud pública significativo asociado a estas cepas virales, incluyendo una amenaza epidémica y pandémica real. La escala de la amenaza se ilustra por la pandemia de influenza de 1918 que mató a más de 50 millones de personas.

Actualmente, no hay vacunas eficaces disponibles para la infección por H5N1, de modo que la inmunoterapia pasiva con inmunoglobulinas puede ser una estrategia alternativa. Se notifica que el uso de inmunización pasiva durante la pandemia de 1918 disminuyó la tasa de mortalidad a la mitad. En vista de su beneficio terapéutico en seres humanos, hay por tanto una necesidad de moléculas de unión, preferiblemente moléculas de unión humanas, que 45 puedan neutralizar a H5N1. La presente invención proporciona estas moléculas de unión y muestra que pueden usarse en medicina, en particular para el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de infecciones por H5N1.

Descripción de las figuras En la figura 1 se presenta el análisis por inmunotransferencia de diferentes hemaglutininas (HA) usando anticuerpos CR6307 (parte izquierda) , CR6323 (parte central) y CR5111 (parte derecha) . Se sometieron HA recombinantes a análisis por SDS-PAGE reductora y análisis por inmunotransferencia. En los carriles 1 se muestra sHA de H5N1TV; en los carriles 2 se muestra HA recombinante, subtipo H5 (A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) ) ; en los carriles 3 se muestra HA recombinante, subtipo H3 (A/Wyoming/3/2003 (H3N2) ) ; y en los carriles 4 se muestra HA recombinante,

subtipo H1 (A/New Caledonia/20/99 (H1N1) ) . También se indica la posición en la que pueden encontrarse HA0, HA1 y HA2.

La figura 2 muestra la puntuación clínica promedio por grupo de ratones en un estudio (ejemplo 12) en el que, un día antes de la infección con virus influenza H5N1, se trataron ratones profilácticamente con tres anticuerpos monoclonales contra H5N1 humanos CR6261, CR6323 y CR6325, en diferentes dosis.

La figura 3 muestra el cambio en el peso corporal durante el tratamiento profiláctico de ratones con anticuerpos anti-H5N1 durante 21 días tras la infección (ejemplo 12) .

La figura 4 muestra el número de ratones supervivientes en los diferentes grupos en el estudio de las figuras 2 y 3 (ejemplo 12) .

La figura 5 muestra la tasa de mortalidad en relación con la dosis administrada de anticuerpos anti-H5N1 en el estudio de la figuras 2-4 (ejemplo 12) .

La figura 6 muestra la puntuación clínica promedio por grupo de ratones en un estudio (ejemplo 13) en el que se infectaron ratones con una dosis letal de virus influenza H5N1 y se trataron en diferentes puntos de tiempo tras la infección (4 h, 1, 2 y 3 días) con anticuerpo monoclonal anti-H5N1 CR6261, o un anticuerpo no relacionado CR2006 (administrado en el día 1 tras la infección) .

La figura 7 muestra el número de animales supervivientes en cada grupo del estudio descrito en la figura 6. Todos los animales del grupo 1-4, excepto un animal en el grupo 1, sobrevivieron todo el estudio hasta el día 21 tras la infección. Todos los animales del grupo 5 habían muerto en el día 9.

La figura 8 muestra el peso corporal promedio de los ratones en cada grupo durante el estudio tal como se describe para la figura 6. La medición del peso corporal de los ratones en el grupo 5 se detuvo en el día 9 ya que todos los ratones en ese grupo habían muerto en ese momento. Todos los ratones que quedaban en los grupos 1-4 alcanzaron niveles normales de peso corporal en el día 21 tras la infección, aunque la rapidez con la que se recuperó cada grupo dependió del tiempo de tratamiento.

La figura 9 muestra el porcentaje de animales supervivientes en cada grupo de un estudio en el que se infectaron ratones con una dosis letal de virus influenza H1N1 y se trataron en diferentes puntos de tiempo (1 día antes, 1, 2 y 3 días tras la infección) con anticuerpo monoclonal anti-H5N1 CR6261, o un anticuerpo no relacionado CR57 (administrado en el día 1 tras la infección) .

La figura 10 muestra el peso corporal promedio de los ratones en cada grupo durante el estudio, tal como se describe para la figura 9. La medición del peso corporal de los ratones en el grupo 5 se detuvo en el día 9 ya que todos los ratones en ese grupo habían muerto en ese momento. Todos los ratones que quedaban en los grupos 1-4 alcanzaron niveles normales de peso corporal en el día 21 tras la infección, aunque la rapidez con la que se recuperó cada grupo dependió del tiempo de tratamiento.

Descripción de la invención A continuación en el presente documento siguen definiciones de términos tal como se usan en la invención.

Tal como se usa en el presente documento, el término “molécula de unión” se refiere a una inmunoglobulina intacta, incluyendo anticuerpos monoclonales, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados o humanos, o a un dominio de unión a antígeno y/o variable que comprende un fragmento de una inmunoglobulina que compite con la inmunoglobulina intacta por la unión específica a la pareja de unión de la inmunoglobulina, por ejemplo H5N1. Independientemente de la estructura, el fragmento de unión a antígeno se une al mismo antígeno que se reconoce por la inmunoglobulina intacta. Un fragmento de unión a antígeno puede comprender un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200 ó 250 residuos de aminoácido contiguos de la secuencia de aminoácidos de la molécula de unión.

El término “molécula de unión”, tal como se usa en el presente documento, incluye todas las clases y subclases de 45 inmunoglobulina conocidas en la técnica. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las moléculas de unión pueden dividirse en las cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos) , por ejemplo, IgA1, IgA2,... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que puede reconocer y unirse a un epítopo en la subunidad HA2 de la proteína hemaglutinina (HA) de influenza, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene actividad neutralizante contra un virus influenza que comprende HA del subtipo H5, tal como H5N1, H5N2, H5N8 y H5N9, y porque el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende los aminoácidos 1-121 de SEQ ID NO: 65 y una región variable de cadena ligera que comprende los aminoácidos 1-112 de SEQ ID NO: 91.

2. Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1, teniendo también dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo actividad neutralizante contra un virus influenza que comprende HA del subtipo H1, tal como H1N1, y preferiblemente teniendo también dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo actividad neutralizante contra un virus influenza que comprende HA del subtipo H2, H6 y/o H9.

3. Anticuerpo humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1 ó 2, comprendiendo el anticuerpo una región CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO:1, una región CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO:2 y una región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:3.

4. Molécula de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para su uso como medicamento y preferiblemente para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de la infección por influenza.

6. Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 5, en el que dicha infección por influenza está provocada por un virus influenza que está asociado con un brote pandémico, o tiene el potencial de asociarse con un brote pandémico.

7. Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 6, en el que dicha cepa del virus influenza que está asociada con un brote pandémico se selecciona del grupo que consiste en: H1N1, H5N1, H5N2, H5N8, H5N9, una cepa basada en H2 y H9N2.

8. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

9. Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para su uso en la profilaxis y/o el tratamiento de una infección por virus influenza.

10. Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para su uso en el diagnóstico de una infección por virus influenza.