Proceso para la purificación de adenovirus a partir de cultivos de alta densidad celular.

Un método para la purificación de partículas de adenovirus a partir de una suspensión celular con una densidad celular que varía de 5x106 a 150x106 células por ml,

comprendiendo dicho método los pasos consecutivos de:

a) lisar las células que contiene dicha suspensión celular;

b) precipitar selectivamente el ADN de la célula huésped que contiene dicha suspensión celular añadiendo un agente de precipitación selectiva, en el que el agente de precipitación selectiva se selecciona entre el grupo compuesto por compuestos de amonio cuaternario, copolímeros de amina y mezclas de los mismos; o

fragmentar el ADN de la célula huésped dentro de dicha suspensión celular añadiendo una nucleasa;

c) someter la suspensión celular obtenida en el paso b) a aclaramiento mediante filtración de flujo tangencial, para obtener una suspensión de adenovirus purificada.

Proceso para la purificación de adenovirus a partir de cultivos de alta densidad celular

La invención se refiere al campo de la producción de virus. Más en particular, se refiere a métodos mejorados para la purificación de partículas de adenovirus a partir de una suspensión celular.

Antecedentes de la invención Los recientes avances en el campo de la producción de vacunas han generado la necesidad de una fabricación a gran escala. Son necesarios procesos sólidos y de alto rendimiento para aportar al mundo cantidades suficientes de vacunas (recombinantes) para combatir las enfermedades infecciosas.

Las vacunas contra enfermedades infecciosas pueden estar basadas en partículas de adenovirus recombinantes. Por este motivo, se han realizado enormes esfuerzos en la optimización de procesos celulares para la producción de adenovirus. Las células se han cultivado a densidades crecientes y, posteriormente, se han infectado para obtener rendimientos víricos totales mayores. Estos procesos de alta densidad celular se describen, por ejemplo, en el documento WO 2010/060719 de Crucell Holland BV y en Yuk y col. (2004) . En estos se describe un proceso para la producción de grandes concentraciones de adenovirus recombinantes. Este proceso optimizado depende de la capacidad para infectar cultivos de alta densidad celular (p. ej., superior a 5x106 células/ml) con el mantenimiento de una alta productividad de virus por célula. En este documento, se ofrece un método para obtener una solución de virus recogida con alta concentración vírica en un único biorreactor. Los rendimientos de partículas víricas (PV) típicas de dichos procesos son de aproximadamente 1, 5-2, 5x1012 PV/ml.

Los procesos en los que las células se cultivan a altas densidades son propensos a la acumulación de altas cantidades de restos celulares y ADN de la célula huésped. Estos contaminantes han de ser eliminados durante el proceso de purificación, lo cual es una operación engorrosa. Un método para eliminar el ADN de la célula huésped de un cultivo celular recogido se describió previamente en el documento US 7326555. El método consiste en la precipitación selectiva del ADN de la célula huésped a partir del cultivo celular. Un agente de precipitación selectiva podría unirse específicamente al ADN de la célula huésped y dejar las partículas de adenovirus sin precipitar. Sin embargo, el método de esta referencia se ha descrito solo para cultivos celulares con baja densidad celular, en los que los restos celulares y el ADN de la célula huésped están presentes en pequeñas cantidades.

Hasta el momento se desconoce si dicho proceso podría aplicarse a un cultivo con alta densidad celular. Por el contrario, a partir de la técnica previa podría deducirse la firme idea de que un agente de precipitación como el que se utiliza en dicho método no podría precipitar de forma selectiva el ADN de la célula huésped del cultivo y podría precipitar las partículas víricas cuando se utiliza a altas concentraciones (Goerke y col. 2004) .

Los cultivos de células que contienen adenovirus recogidos generalmente se procesan adicionalmente para obtener los adenovirus purificados. Normalmente se incluye una etapa de aclaramiento, como filtración en profundidad y/o filtración de flujo tangencial (FFT) en dicho proceso de purificación. El uso de FFT requiere una recogida relativamente limpia, es decir, que contenga cantidades limitadas de restos celulares o de otras impurezas como por ejemplo, ADN de la célula huésped. Un exceso de dichas impurezas podría posiblemente bloquear los filtros. En consecuencia, el aclaramiento mediante FFT se utiliza normalmente más adelante en el proceso de purificación, por ejemplo, como tercer o cuarto paso de dicho proceso de purificación.

La separación de adenovirus de una suspensión celular que contiene adenovirus directamente tras la recogida, usando filtración de flujo tangencial se ha descrito previamente, por ejemplo, en el documento EP 1371723. Sin embargo, el adenovirus se crecía en células adherentes, que permanecían en el biorreactor tras la recogida. Por tanto, la suspensión que contiene los virus que se procesó adicionalmente contenía concentraciones muy bajas de restos celulares y de ADN de la célula huésped. En el documento WO 2006/052302 también se describe el uso de FFT directamente tras la recogida. Sin embargo, las densidades celulares de los cultivos recogidos que contenían virus usados en este documento eran mucho menores de 5x106 células/ml. Como se describe en este documento, el uso de FFT en el paso de aclaramiento directamente tras la recogida no es posible en cultivos celulares que contiene altas densidades de células.

En el artículo de Biotechnology and Bioengineering, vol. 90, 2005, 645-655 se describe la capacidad de las células PER.C6 para crecer a densidades del orden de 9x106 células por ml, la infección de las mismas con adenovirus y la obtención de adenovirus mediante un proceso de lisis con detergente, eliminando a continuación los restos celulares mediante centrifugación. La infección de las células crecidas a la densidad indicada con adenovirus daba lugar a una productividad volumétrica alta de virus, aunque la productividad específica de la célula disminuyó (véase el párrafo puente entre las páginas 652-3) .

Puesto que los procesos de cultivo celular se han escalado y las células se han cultivado a densidades crecientes, existe la necesidad en la industria de procesos en pasos sucesivos que permitan el tratamiento de suspensiones de alta densidad celular. Esto se aplica en particular al campo de la producción de adenovirus.

Sumario de la invención La presente invención se refiere a métodos para la purificación de partículas de adenovirus a partir de un lisado celular de una suspensión de alta densidad celular.

Los intentos de purificación de adenovirus a partir de una suspensión de alta densidad celular con procesos existentes daban lugar a una recuperación muy baja de virus, como se ilustra en este documento (ejemplo 1) . Las concentraciones de impurezas en dicha suspensión de alta densidad celular obtenida tras la recogida fueron generalmente demasiado altas como para permitir una purificación directa del adenovirus. El procesamiento en pasos sucesivos de suspensiones de alta densidad celular usando procesos conocidos podría requerir normalmente una multitud de pasos. Un primer paso de filtración podría consistir en una filtración grosera para eliminar precipitados grandes y restos celulares. Posteriormente, serían necesarios uno o dos pasos más de filtración selectivos para obtener una suspensión de adenovirus suficientemente purificada.

Sorprendentemente, los autores han encontrado y descrito en este documento que directamente después de preparar el lisado celular que contiene el adenovirus, el uso consecutivo de la fragmentación y/o precipitación del ADN de las células huésped seguido de un paso de aclaramiento que comprende una filtración de flujo tangencial (FFT) tiene como resultado una suspensión de adenovirus altamente purificada.

Sorprendentemente, podría procesarse de forma eficaz el lisado celular que contiene adenovirus, grandes cantidades de restos celulares, ADN de la célula huésped y otras impurezas para purificar el adenovirus con la presente invención. En este documento, la presente invención proporciona un proceso novedoso para eliminar el ADN de la célula huésped en procesos de purificación de adenovirus a gran escala.

Con la incorporación de la fragmentación o precipitación del ADN dentro del proceso de purificación, era suficiente un único paso de aclaramiento para purificar el adenovirus a partir de una suspensión de alta densidad celular, usando FFT para el aclaramiento.

La invención es la siguiente:

1. Un método para la purificación de partículas de adenovirus a partir de una suspensión celular con una densidad celular que varía de 5x106 a 150x106 células por ml, comprendiendo dicho método los pasos consecutivos de:

a) lisar las células que contiene dicha suspensión celular;

b) precipitar selectivamente el ADN de la célula huésped que contiene dicha suspensión celular añadiendo un agente de precipitación selectiva, en el que el agente de precipitación selectiva se selecciona entre el grupo compuesto por compuestos de amonio cuaternario, copolímeros de amina y mezclas de los mismos; o fragmentar el ADN de la célula huésped dentro de dicha suspensión celular añadiendo una nucleasa;

c) someter la suspensión celular obtenida en el paso b) a aclaramiento mediante filtración de flujo tangencial, para obtener una suspensión de adenovirus purificada.

2. Un método para purificar... [Seguir leyendo]

1. Un método para la purificación de partículas de adenovirus a partir de una suspensión celular con una densidad celular que varía de 5x106 a 150x106 células por ml, comprendiendo dicho método los pasos consecutivos de:

a) lisar las células que contiene dicha suspensión celular; b) precipitar selectivamente el ADN de la célula huésped que contiene dicha suspensión celular añadiendo un agente de precipitación selectiva, en el que el agente de precipitación selectiva se selecciona entre el grupo compuesto por compuestos de amonio cuaternario, copolímeros de amina y mezclas de los mismos;

o fragmentar el ADN de la célula huésped dentro de dicha suspensión celular añadiendo una nucleasa; c) someter la suspensión celular obtenida en el paso b) a aclaramiento mediante filtración de flujo tangencial, para obtener una suspensión de adenovirus purificada.

2. Un método para purificar partículas de adenovirus de acuerdo con la reivindicación 1 en el que dicha precipitación del paso b) se realiza mediante precipitación selectiva del ADN de la célula huésped a partir de las partículas víricas mediante la adición del agente de precipitación selectiva.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho agente de precipitación selectiva es bromuro de domifeno (BD) .

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la concentración de bromuro de domifeno (BD) está en el intervalo de 1, 2 a 5 mM.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la densidad celular está en el intervalo de aproximadamente 10x106 a 30x106 células por ml y la concentración de bromuro de domifeno (BD) oscila de 1, 3 a 2 mM.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en el que dicha filtración de flujo tangencial se realiza con una membrana que tiene un tamaño de poro que oscila de 0, 1 a 0, 65 !m.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que dicha filtración de flujo tangencial se realiza con fibra hueca.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que dicha filtración de flujo tangencial se realiza con un sistema de FTA.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que al menos el 80% del ADN de la célula huésped se ha eliminado en la suspensión de adenovirus purificada.