Sistemas de empaquetamiento para adenovirus recombinante humano utilizado en terapia génica.

LA INVENCION PROPORCIONA METODOS MEJORADOS Y PRODUCTOS BASADOS EN MATERIALES DE ADENOVIRUS QUE PUEDEN UTILIZARSE VENTAJOSAMENTE POR EJEMPLO EN TERAPIA GENICA.

EN OTRO PUNTO SE PROPORCIONA UN VECTOR DE ADENOVIRUS QUE NO TIENE SOLAPAMIENTO CON UNA LINEA DE EMPAQUETAMIENTO DE CELULAS ADECUADAS QUE ES OTRO ASPECTO DE LA INVENCION. ESTA COMBINACION EXCLUYE LA POSIBILIDAD DE RECOMBINACION HOMOLOGA, CON LO QUE SE EXCLUYE LA POSIBILIDAD DE FORMACION DE ADENOVIRUS COMPETENTES PARA LA REPLICACION. EN OTRO PUNTO SE PRESENTA UNA CONSTRUCCION COLABORADORA BASADA EN EL ADENOVIRUS QUE POR SUS DIMENSIONES ES IMPOSIBLE DE ENCAPSIDAR. ESTE VIRUS COLABORADOR PUEDE TRANSFERIRSE A OTRA CELULA HUESPED ADECUADA CONVIRTIENDOLA EN UNA CELULA DE EMPAQUETAMIENTO. ADEMAS, SE PRESENTA UNA SERIE DE MUTACIONES UTILES A MATERIALES BASADOS EN ADENOVIRUS Y COMBINACIONES DE DICHAS MUTACIONES, QUE TIENEN TODAS EN COMUN LA SEGURIDAD DE LOS METODOS Y LOS PRODUCTOS, EN PARTICULAR QUE EVITAN LA PRODUCCION DE ADENOVIRUS COMPETENTES PARA LA REPLICACION Y/O LA INTERFERENCIA CON EL SISTEMA INMUNITARIO. ADEMAS, SE PRESENTA UN METODO DE AMPLIFICACION INTRACELULAR.

Sistemas de empaquetado para adenovirus recombinante en el hombre destinado a la terapia génica.

La invención se refiere al campo de la tecnología del ADN recombinante, más concretamente al campo de la terapia génica. En particular la invención se refiere a la terapia génica en la que se utilizan materiales derivados de adenovirus, en particular adenovirus recombinante humano. Especialmente se refiere a vectores derivados de virus novedosos y líneas celulares de empaquetamiento novedosas para vectores basados en adenovirus.

La terapia génica es un concepto desarrollado recientemente para el cual se pueden y se han ideado una amplia gama de aplicaciones.

En la terapia génica se introduce una molécula que porta información genética en algunas o todas las células de un huésped, como resultado de lo cual se añade información genética al huésped en un formato funcional.

La información genética añadida puede ser un gen o un derivado de un gen, tal como un ADNc, que codifica una proteína. En este caso el formato funcional significa que la proteína puede ser expresada por la maquinaria de la célula huésped.

La información genética también puede ser una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos (ya sea ADN o ARN) presente en la célula huésped. El formato funcional en este caso consiste en que la molécula de ADN (ácido nucleico) añadida o las copias realizadas de la misma in situ sean capaces de emparejar las bases con la secuencia complementaria presente en la célula huésped.

Entre las aplicaciones se incluyen el tratamiento de las alteraciones genéticas suplementando una proteína u otra sustancia que, debido a dicha alteración genética, no se encuentra presente o al menos está presente en cantidades insuficientes en el huésped, el tratamiento de tumores y (otras) enfermedades adquiridas tales como las enfermedades (auto)inmunes o infecciones, etc.

Como puede resultar evidente a partir de lo anterior, existen básicamente tres enfoques diferentes en terapia génica, uno dirigido a compensar una deficiencia presente en un huésped (mamífero); el segundo dirigido a la separación o eliminación de sustancias no deseadas (organismos o células) y el tercero a la aplicación de una vacuna recombinante (tumores o microorganismos foráneos).

Para el propósito de la terapia génica, se han propuesto como vehículos adecuados adenovirus que portan deleciones. Los adenovirus son virus con ADN sin envuelta. Los vectores de transferencia génica derivados de adenovirus (denominados vectores virales) tienen numerosos rasgos que los hacen particularmente útiles para la transferencia génica con tales fines. Por ejemplo, la biología de los adenovirus está caracterizada con detalle, el adenovirus no está asociado a patologías humanas graves, el virus es extremadamente eficaz al introducir su ADN en la célula huésped, el virus puede infectar una amplia variedad de células y tiene una amplia gama de huéspedes, el virus puede ser producido en grandes cantidades con relativa facilidad, y el virus se puede volver de replicación deficiente mediante deleciones en la región temprana 1 (E1) de genoma viral.

El genoma de los adenovirus es una molécula de ADN de doble hebra lineal de aproximadamente 36.000 pares de bases con la proteína terminal de 55 kDa unida covalentemente al extremo 5' de cada hebra. El ADN de Ad contiene Repeticiones Terminales Invertidas (ITR) idénticas de aproximadamente 100 pares de bases dependiendo de la longitud exacta del serotipo. Los orígenes de replicación virales están localizados en las ITR exactamente en los extremos del genoma. La síntesis de ADN se produce en dos fases. Primero, la replicación se desarrolla mediante desplazamiento de la hebra, generando una molécula dúplex hija y una hebra desplazada parental. La hebra desplazada es de hebra sencilla y puede formar un intermedio denominado panhandle, que permite el inicio de la replicación y la generación de una molécula dúplex hija. Alternativamente, la replicación puede desarrollarse desde ambos extremos del genoma simultáneamente, obviando el requerimiento de formar la estructura panhandle. La replicación se resume en la Figura 14 adaptada de (Lechner and Kelly, 1977).

Durante el ciclo de infección productivo, los genes virales son expresados en dos fases: la fase temprana, que es el período hasta la replicación del ADN viral, y la fase tardía, que coincide con el inicio de la replicación del ADN viral. Durante la fase temprana sólo se expresan los productos génicos tempranos, codificados por las regiones E1, E2, E3 y E4, que portan numerosas funciones que preparan la célula para la síntesis de las proteínas estructurales virales (Berk, 1986). Durante la fase tardía se expresan los productos génicos virales tardíos además de los productos génicos tempranos y se disparan la síntesis de ADN y de proteínas de la célula huésped. Por consiguiente, la célula se dedica a la producción de ADN viral y de proteínas estructurales virales (Tooze, 1981).

La región E1 del adenovirus es la primera región del adenovirus expresada después de la infección de la célula diana. Esta región consta de dos unidades transcripcionales, los genes E1A y E1B, ambos requeridos para la transformación oncogénica de cultivos de roedor primarios (embrionarios). Las principales funciones de los productos génicos E1A son:

i) inducir a las células quiescentes a entrar en el ciclo celular y reanudar la síntesis de ADN celular, y

ii) activar transcripcionalmente el gen E1B y las otras regiones tempranas (E2, E3, E4). La transfección de las células primarias con el gen E1A solo puede inducir una proliferación ilimitada (inmortalización), pero no da como resultado una transformación completa. Sin embargo, la expresión de E1A en la mayoría de los casos da como resultado la inducción de la muerte celular programada (apoptosis), y sólo ocasionalmente se obtiene la inmortalización (Jochemsen y col., 1987). La co-expresión del gen E1B es requerida para evitar la inducción de la apoptosis y para hacer que se produzca la transformación morfológica completa. En líneas celulares inmortales establecidas, un elevado nivel de expresión de E1A puede causar la transformación completa en ausencia de E1B (Roberts y col., 1985).

Las proteínas codificadas por E1B ayudan a E1A a redirigir las funciones celulares para permitir la replicación viral. Las proteínas E1B de 55 kD y E4 de 33 kD, que forman un complejo que se localiza esencialmente en el núcleo, funcionan inhibiendo la síntesis de las proteínas del huésped y facilitando la expresión de los genes virales. Su principal influencia consiste en establecer un transporte selectivo de ARNm virales desde el núcleo hasta el citoplasma, simultáneamente al comienzo de la fase tardía de la infección. La proteína E1B de 21 kD es importante para corregir el control temporal del ciclo de infección productivo, evitando de ese modo la muerte prematura de la célula huésped antes de que el ciclo vital del virus se haya completado. Los virus mutantes incapaces de expresar el producto génico E1B de 21 kD manifiesta un ciclo de infección acortado que está acompañado de una degradación excesiva del ADN cromosómico de la célula huésped (fenotipo deg) y un efecto citopático intensificado (fenotipo cyt) (Telling y col., 1994). Los fenotipos deg y cyt son suprimidos cuando además el gen E1A es mutado, indicando que estos fenotipos son una función de E1A (White y col., 1988). Además, la proteína E1B de 21 kDa disminuye la velocidad mediante la cual E1A pone en marcha los otros genes virales. No se sabe todavía a través de qué mecanismo E1B de 21 kD sofoca estas funciones dependientes de E1A.

Los vectores derivados de adenovirus humanos, en los que al menos la región E1 ha sido suprimida y remplazada por un gen de interés, han sido extensamente utilizados para experimentos de terapia génica en fase pre-clínica y clínica.

Como se ha establecido antes, todos los vectores de adenovirus utilizados en la actualidad en terapia génica tienen una deleción en la región E1, donde se puede introducir información genética novedosa. La deleción de E1 vuelve al virus recombinante de replicación deficiente (Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991). Los autores de la presente invención han demostrado que los adenovirus recombinantes son capaces transferir eficazmente genes recombinantes al hígado de rata y al epitelio de las vías respiratorias de monos rhesus... [Seguir leyendo]

1. Un sistema de empaquetamiento que comprende:

una molécula de ácido nucleico recombinante basada en o derivada de adenovirus, teniendo dicha molécula de ácido nucleico una señal de encapsidación funcional y al menos una Repetición Terminal Invertida funcional o un fragmento funcional o un derivado del mismo, y

una célula de empaquetamiento, comprendiendo dicho ácido nucleico recombinante y dicha célula de empaquetamiento juntos todos los elementos que son necesarios para generar una partícula adenoviral recombinante que comprende dicha molécula de ácido nucleico recombinante, donde dicha molécula de ácido nucleico recombinante no tiene secuencias solapantes que permitan la recombinación homóloga que conduce a un virus de replicación competente en dicha célula de empaquetamiento.

2. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 1, donde dicha molécula de ácido nucleico es una forma lineal y comprende una Repetición Terminal Invertida en ambos extremos o cerca de ellos.

3. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 1, donde dicha molécula de ácido nucleico es una forma lineal y de hebra esencialmente sencilla y comprende en el extremo 3' una secuencia complementaria a una porción curso arriba de la misma hebra de dicha molécula de ácido nucleico, siendo capaz dicha secuencia de emparejar las bases con dicha porción de manera que sea capaz de funcionar como un sitio de partida para una polimerasa de ácido nucleico.

4. Un sistema de empaquetamiento que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante resultante de la acción de una polimerasa de ácido nucleico sobre una molécula de ácido nucleico formada por un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 3.

5. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 4, donde dicha molécula de ácido nucleico tiene una Repetición Terminal Invertida en ambos extremos.

6. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 1, donde dicha célula de empaquetamiento comprende una molécula de ácido nucleico con una mutación de la gama de huésped.

7. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 1, donde dicha célula de empaquetamiento comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una región E2 mutada haciendo al menos uno de sus productos sensible a la temperatura.

8. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 1, donde dicha célula de empaquetamiento comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una región E2 bajo el control de un promotor inducible.

9. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 1, donde dicha célula de empaquetamiento ha sido proporcionada con una o más moléculas de ácido nucleico de empaquetamiento que proporcionan a dicha célula la capacidad de expresar productos génicos adenovirales derivados al menos de la región E1A.

10. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 9, donde dichas una o más moléculas de ácido nucleico de empaquetamiento proporcionan adicionalmente a dicha célula la capacidad de expresar productos génicos adenovirales derivados de la región E2A.

11. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 10, donde la molécula de ácido nucleico recombinante que codifica la región E2A está bajo el control de un promotor inducible.

12. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 10 u 11, donde la molécula de ácido nucleico recombinante que codifica la región E2A está mutado de manera que al menos uno de sus productos sea sensible a la temperatura.

13. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 9, donde dicha célula de empaquetamiento no tiene la capacidad de expresar los productos de E1B.

14. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 13, donde la información genética que codifica los productos de E1B no está presente.

15. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 9, donde dicha célula de empaquetamiento comprende adicionalmente la región que codifica E1B.

16. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 9, donde dicha célula de empaquetamiento comprende adicionalmente un gen marcador.

17. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 16, por medio del cual el gen marcador está bajo el control del promotor responsable de E1B.

18. Una célula de empaquetamiento que alberga un fragmento de ADN de un adenovirus, constando ese fragmento de los nucleótidos 80-5.788 del genoma del Adenovirus 5 humano.

19. Una célula de empaquetamiento que alberga un fragmento de ADN de un adenovirus, constando ese fragmento de los nucleótidos 459-1.713 del genoma del Adenovirus 5 humano.

20. Una célula de empaquetamiento que alberga un fragmento de ADN de un adenovirus, constando ese fragmento de los nucleótidos 459-3.510 del genoma del Adenovirus 5 humano.

21. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 9, donde dicha célula de empaquetamiento no tiene la capacidad de expresar el producto de E1B de 21 kD.

22. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 21, donde la información genética que codifica el producto E1B de 21 kD no está presente en dicha célula de empaquetamiento.

23. Un sistema de empaquetamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9-17, 21 ó 22, donde dicha célula de empaquetamiento es una célula diploide.

24. Un sistema de empaquetamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9-17 ó 21-23, donde dicha célula de empaquetamiento no es de origen humano.

25. Un sistema de empaquetamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9-17 ó 21-24, donde dicha célula de empaquetamiento tiene su origen en el mono.

26. Una célula según la reivindicación 18 consignada con el núm. 95062101 en el ECACC.

27. Un sistema de empaquetamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-17 ó 21-25, donde dicha molécula de ácido nucleico recombinante es una molécula de ADN.

28. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 1, donde dicha molécula de ácido nucleico recombinante tiene al menos una deleción de los nucleótidos 459-3.510 de la región E1.

29. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 1, donde dicha molécula de ácido nucleico recombinante tiene al menos una deleción de los nucleótidos 459-1.713 de la región E1.

30. Un lote de partículas de adenovirus recombinante producido por un sistema de empaquetamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, 21-25 ó 27-29, cuyo lote está libre de partículas de replicación competente.

31. Una célula que comprende un sistema de empaquetamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, 21-25 ó 27-29.

32. Un sistema de empaquetamiento según una cualquiera de las reivindicación 1-3, donde dicha molécula de ácido nucleico comprende los genes E2A y E2B funcionales o fragmentos funcionales o derivados de los mismos bajo el control de un promotor independiente de E1A.

33. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 25, donde dicha célula de empaquetamiento comprende una región E2A de adenovirus mutada para la gama de huésped.

34. Una célula según la reivindicación 20 consignada con el núm. 96022940 en la ECACC.

35. Una célula de empaquetamiento para empaquetar adenovirus derivados de moléculas de ácido nucleico, a cuya célula de empaquetamiento se han proporcionado una o más moléculas de ácido nucleico de empaquetamiento, proporcionando dichas moléculas de ácido nucleico o las moléculas de ácido nucleico a dicha célula la capacidad de expresar productos génicos adenovirales derivados al menos tanto de la región de E1A como de la de E2A, donde la molécula de ácido nucleico recombinante que codifica la región E2A es mutada de manera que al menos uno de sus productos es sensible a la temperatura.

36. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 1, donde el genoma de dicha célula de empaquetamiento comprende un ácido nucleico que codifica las proteínas E1A y E1B adenovirales pero carece de las secuencias pIX.

37. Un sistema de empaquetamiento según la reivindicación 36, donde dicha célula de empaquetamiento es una célula PER.C6 consignada con el núm. 96022940 en la ECACC.

38. Una célula, caracterizada porque comprende en su genoma ácido nucleico que codifica las proteínas E1A y E1B adenovirales pero carece de secuencias pIX.