Producción de poliovirus con títulos elevados para producción de vacunas.

Un proceso para la producción de poliovirus, que comprende las etapas de:

a) proporcionar un cultivo de células en suspensión sin suero, las cuales son células PER.C6 5 depositadas con el número 96022940 de la ECACC,

b) infectar dichas células con poliovirus, a una densidad celular de entre 2×106 células/ml y 150×106 células/ml, y

c) recoger los poliovirus en un momento entre las 12 y las 48 horas después de la infección.

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DESCRIPCIÓN

Producción de poliovirus con títulos elevados para producción de vacunas La invención se refiere al campo del cultivo celular y producción de poliovirus. Más en particular, se refiere a métodos mejorados para el cultivo de células y producción de poliovirus a partir del mismo para la producción de vacunas de la poliomielitis.

Antecedentes de la invención Los poliovirus son miembros del género Enterovirus de la familia Picornaviridae. Los poliovirus son virus pequeños, sin envoltura y con cápsides que encierran un genoma ARN monocatenario de sentido positivo. Hay tres tipos de poliovirus: los tipos 1, 2 y 3. Las infecciones por poliovirus de individuos susceptibles pueden causar poliomielitis paralítica. La poliomielitis es muy contagiosa. Se han desarrollado dos vacunas contra la polio diferentes, la vacuna contra la polio inactivada (IPV) de Salk y la vacuna contra la polio oral viva atenuada (OPV) de Sabin. Ambas vacunas son seguras y efectivas. Cada una tiene sus ventajas y desventajas en particular, y ambas han tenido un papel importante en el control de la poliomielitis. Para una revisión sobre los poliovirus y las vacunas contra la polio, véase Kew y col., 2005.

La vacuna contra la polio oral (OPV) es barata y cómoda y se ha usado de forma masiva. Sin embargo, receptores ocasionales sufren poliomielitis paralítica asociada a la vacuna (PPAV) debido a revertientes en la vacuna. Asimismo, se ha observado en poblaciones que no han sido completamente inmunizadas que las cepas de poliovirus atenuados de Sabin han sufrido suficientes cambios mutacionales como para causar brotes de enfermedad paralítica que son clínica y epidemiológicamente indistinguibles de la poliomielitis producida por virus de tipo salvaje; estos mutantes se denominan poliovirus circulantes derivados de vacunas o PVDVc (véase Kew y col., 2005; Wright y Modlin, 2008; Yakovenko y col., 2009) .

Existe cada vez más consenso acerca de que la vacuna contra la polio inactivada (IPV) puede contribuir a la erradicación más rápida del poliovirus de tipo salvaje y al control de los PVDVc que aparecen cuando se usan junto con las estrategias de OPV existentes (Wright y Modlin, 2008; John, 2009) .

No obstante, la producción de IPV es más cara (véase p. ej., John, 2009) y puede incluso ser prohibitivamente cara para los países menos desarrollados, en los que aún existe una fuerte necesidad de vacunas contra la polio. Los sistemas de cultivo para la producción de material de partida de poliovirus que se pueda usar en una vacuna, en particular poliovirus no atenuados, contribuyen en gran medida a los costes relativamente elevados.

Por tanto, sigue existiendo la necesidad en la técnica de sistemas de cultivo eficientes para la producción de poliovirus para uso en vacunas.

La propagación del poliovirus en células HEK293 se ha descrito como un sistema para el estudio de fenotipos de poliovirus de replicación específica en neuronas, y se describió que las formas atenuadas de poliovirus, tales como aquellas que contienen mutaciones puntuales en un elemento IRES como presentan las cepas de Sabin, mostraban una reducida propagación en células HEK293 (Campbell y col, 2005) .

Las células de retina embrionaria humana (HER) inmortalizadas E1, en particular las células PER.C6, se han descrito como idóneas para la propagación de diversos virus, con énfasis en el virus de la gripe (Pau y col., 2001; documento WO 01/38362) . Aunque en el documento WO 01/38362 se describen ejemplos experimentales de propagación de diversas cepas del virus de la gripe y del virus del herpes simple (VHS) de tipos 1 y 2, virus del sarampión y rotavirus en células PER.C6, la propagación de poliovirus no se muestra en dicho documento WO 01/38362. Además, las condiciones para la replicación del poliovirus en dichas células no se han descrito y no se pueden predecir fácilmente en función de la replicación de virus no relacionados en estas células. Por tanto, se desconoce hasta ahora si sería viable producir económicamente poliovirus a escala industrial para los fines de producción de vacunas en estas células.

Para la fabricación a gran escala de vacunas contra la polio inactivadas, los poliovirus se propagan en general en células Vero que se obtienen de mono. Las células Vero son muy utilizadas para la producción de vacunas, tanto vacunas contra la polio inactivadas como vivas atenuadas, y hasta el momento son las líneas celulares continuas más ampliamente aceptadas por la autoridades sanitarias para la fabricación de vacunas virales, y se espera que aumente el uso de estas células para la producción de vacunas por los expertos en el campo (Barrett y col., 2009) .

Montagnon y col. (1982 y 1984) describen cultivos microtransportadores a gran escala de células Vero para vacunas contra la polio inactivadas. En la patente de EE. UU. nº 4.525.349 también se describe un proceso para la producción a gran escala de una vacuna contra la polio usando células Vero.

Merten y col., (1997) describieron la producción de títulos altos de poliovirus (Sabin tipo 1) (casi 2×109 TCID50/ml) para condiciones en las que se cultivaron células Vero en microtransportadores en medio con suero antes de la fase E10729895

de producción de virus en medio sin suero, pero en vista de las desventajas de usar suero, estos autores indicaron ya que era deseable un proceso completamente sin suero y en tal proceso completamente sin suero optimizado dichos autores fueron capaces de obtener un título de 6, 3×108 TCID50/ml.

Kreeftenberg y col. (2006) , dedicados a la producción de poliovirus para la producción de vacunas a escala industrial, también mencionan rendimientos de varias cepas de tipo salvaje y de Sabin de poliovirus en células Vero crecidas en microtransportadores, cuyos rendimientos son similares para las diferentes cepas, estando los títulos logarítmicos entre 8, 1 y 8, 6. Estos autores también describen que la cantidad de virus necesaria para producir la vacuna final es significativamente superior para IPV que para OPV, lo cual tiene como resultado un coste de producción por dosis significativamente mayor para IPV que para OPV.

La producción sin suero de poliovirus usando células Vero cultivadas en microtransportadores también ha sido descrita por Card y col. (2005) y, aunque el nivel de productividad era menor que en cultivos estáticos, los cultivos de microtransportadores se describieron como más fáciles de aplicar a mayor escala.

A pesar de la eficacia y la aplicabilidad industrial de estos cultivos de células Vero basados en microtransportadores, la producción de grandes cantidades de poliovirus sigue siendo costosa y, por tanto, sigue existiendo la necesidad de sistemas de producción alternativos para poliovirus que acusen menos esta desventaja.

Se ha descrito la producción de poliovirus usando célula Vero en suspensión, lo que tiene como resultado títulos más bajos de virus (10log CCID50/ml entre 6, 5 y 7, 9) que los observados en células Vero en microtransportadores convencionales (van Eikenhorst y col., 2009) .

Bjare (1984) describe la producción de poliovirus en células linfoblastoides humanas en condiciones sin suero, con un título TCID50 medio de aproximadamente 7, 5 10log/ml el día 4 después de la infección.

Es un objeto de la invención proporcionar procesos idóneos que pueden usarse para la producción a gran escala y económica de poliovirus para su uso en vacunas. Esto puede ayudar a proporcionar acceso a vacunas contra la polio asequibles en los países en desarrollo en una base sostenible.

Sumario de la invención La invención se basa en la demostración de una propagación muy eficiente de poliovirus en células PER.C6, en la que se obtienen títulos elevados de poliovirus sin precedentes según los procedimientos descritos en este documento. La obtención de estos títulos elevados, que proporcionan una ventaja económica significativa sobre la producción de poliovirus en células Vero, no podía preverse en función de la replicación de otros virus en dichas células, ni podían preverse las condiciones para un proceso factible a nivel industrial, puesto que las condiciones y las ventajas que se pueden obtener pueden variar ampliamente para los diferentes tipos de virus que tienen propiedades considerablemente diferentes.

Así, la invención proporciona un proceso para la producción de poliovirus que comprende los siguientes pasos: a) proporcionar un cultivo de células en suspensión sin suero, las cuales son células PER.C6 depositadas con el número 96022940 de la ECACC, b) infectar dichas células con poliovirus, a una densidad celular de entre... [Seguir leyendo]

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1. Un proceso para la producción de poliovirus, que comprende las etapas de:

a) proporcionar un cultivo de células en suspensión sin suero, las cuales son células PER.C6 depositadas con el número 96022940 de la ECACC, b) infectar dichas células con poliovirus, a una densidad celular de entre 2×106 células/ml y 150×106 células/ml, y c) recoger los poliovirus en un momento entre las 12 y las 48 horas después de la infección.

2. Un proceso según la reivindicación 1, en el que dicha infección y/o propagación del virus se realiza a una temperatura de entre 34 y 36º C.

3. Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha infección se realiza a una densidad celular de entre aproximadamente 5×106 células/ml y 20×106 células/ml.

4. Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha infección se realiza a una densidad celular de aproximadamente 10×106 células/ml. 20

5. Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha infección se realiza a una multiplicidad de infección (MOI) de entre 1 y 3, por ejemplo alrededor de 2.

6. Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la recogida de dicho poliovirus se

realiza en un momento entre las 18 y las 30 horas después de la infección, por ejemplo, alrededor de 24 horas después de la infección.

7. Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho poliovirus es un poliovirus de tipo 1, un poliovirus de tipo 2 o un poliovirus de tipo 3. 30

8. Un proceso según la reivindicación 7, en el que dicho poliovirus es un poliovirus de tipo 1 de la cepa Mahoney, un poliovirus de tipo 2 de la cepa MEF o un poliovirus de tipo 3 de la cepa Saukett.

9. Un proceso según la reivindicación 7, en el que dicho poliovirus es un poliovirus atenuado, como una cepa Sabin. 35

10. Un proceso para la producción de una vacuna contra la polio, que comprende un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente purificar, inactivar opcionalmente y formular los poliovirus recogidos para obtener una vacuna contra la polio.