Miméticos de lazo de horquilla beta fijados a patrón y su utilización en exposición en fagos.

Compuesto de la fórmula R1-Cys-Z-Cys-R2 (I), en el cual

cada uno de los Cys es un residuo L-cisteína,

los dos grupos -SH de los dos residuos L-cisteína se sustituyen por un grupo -S-S-, R1 y R2 son Glu-Thr y Thr-Lys; o Lys-Thr y Thr-Glu; o Thr-Glu y Lys-Thr; o Thr-Lys y Glu-Thr; o Leu- Glu y Lys-Val; o Val-Lys y Glu-Leu; o Glu-Leu y Val-Lys; o Lys-Leu y Val-Glu; o Glu-Leu-Lys y Glu-Val-Lys; o Lys- Val-Glu y Lys-Leu-Glu; o Leu-Glu-Lys y Glu-Lys-Val; o Val-Lys-Glu y Lys-Glu-Leu; o Glu-Lys-Leu y Val-Glu-Lys; o Lys-Glu-Val y Leu-Lys-Glu; o Lys-Glu-Leu y Val-Lys-Glu; o Glu-Lys-Val y Leu-Glu-Lys, y Z es una cadena de 6 hasta 20 residuos aminoacídicos, siendo cada uno de estos residuos, independientemente, el residuo de un aminoácido L10 alfa de origen natural, con la condición, de que Z contenga una de las fracciones -Lys-Trp- Phe-Ser-Asn-His-Tyr-Gln- [SEQ ID NO:23]; y -Phe-Leu-Ala-His-Tyr-Ala- [SEQ ID NO:24].

Miméticos de lazo de horquilla beta fijados a patrón y su utilización en exposición en fagos La presente invención da a conocer compuestos peptídicos formados por residuos de origen natural de L-alfaaminoácidos, de los cuales ciertos residuos, dependiendo de sus posiciones, son residuos de cisteína, unidos mediante un enlace disulfuro, por consiguiente forman estructuras peptídicas cíclicas, y otros residuos concretos, que son adyacentes a dichos residuos de cisteína, forman fracciones de dipéptidos o tripéptidos de ciertos tipos, tal y como se define a continuación, que actúan conjuntamente como un patrón, para facilitar la formación y estabilización de estructuras de lazo de horquilla beta. Debido a su estabilidad y vínculos, estos miméticos de lazo de horquilla beta estabilizado mediante un patrón presentan una actividad mayor o, más prolongada, en comparación con los complejos de unión proteicos.

Los patrones se pueden transferir a la construcción de miméticos de lazo de horquilla derivados de la técnica de exposición en fago para el cribado de bibliotecas y fármacos. Los compuestos de la presente invención son útiles para el cribado e identificación de proteínas que interactúan entre ellas in vitro. La presente invención se puede utilizar como una herramienta de búsqueda guía para encontrar dianas, en las que sea difícil transferir epítopos de proteínas a pequeños péptidos o miméticos de péptidos.

Se conocen compuestos peptídicos con estructuras, que muestran similitudes a las estructura de los compuestos de la presente invención, por ejemplo de N. C. Wrighton y otros, Science 1996, 273, 458-463; S. C. Shankaramma y otros, ChemBioChem 2002, 3, 1126-1133; y WO-A-00/77194.

Los lazos que se encuentran en la superficie de proteínas y péptidos bioactivos, a menudo están implicados en el reconocimiento por parte de complejos de unión proteicos. En consecuencia, es interesante investigar dichos lazos ya que pueden ser guías potenciales para el descubrimiento de fármacos. Las horquillas beta tienen un interés especial: el motivo de horquilla beta es muy abundante en la naturaleza y aparece en la superficie de muchos ligandos de proteínas y en las regiones hipervariables de los anticuerpos. El motivo de horquilla beta consiste en dos cadenas beta antiparalelas unidas por un lazo o giro breve y se clasifica en función de la red de enlaces hidrogeno (B. L. Sibnda y otros, J. Mol. Biol. 1989, 206, 759-777) .

Actualmente ya se pueden generar peptidomiméticos de horquilla beta mediante el método de síntesis combinatoria y paralela (L. Jiang y otros, Helv. Chim. Acta 2000, 83, 3097-3112) . Sin embargo, puede que estas moléculas no se sinteticen en bibliotecas de 1010 ó 1012 miembros.

Una estrategia complementaria en el descubrimiento de las guías basadas en péptidos es la exposición de bibliotecas en bacteriófagos filamentosos, que permite la creación de bibliotecas de hasta 1010 a 1012 miembros, muchas magnitudes superior a las bibliotecas que se podrían elaborar sintéticamente.

Además, existen métodos de selección rápidos y económicos para identificar los miembros de dichas bibliotecas, que se unen a la diana que se está estudiando. La técnica de exposición en fago permite la construcción de péptidos unidos cíclicos, como los lazos de la horquilla beta con uniones disulfuro, como es bien sabido (H. B. Lowman, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1997, 26, 401-24) .

Dichos lazos tienen un número limitado de conformaciones, que pueden dar como resultado el aislamiento de los ligandos de afinidad de la diana del receptor. Sin embargo, los péptidos cíclicos que se estabilizan con un único enlace disulfuro tienen una conformación bastante flexible. Además, como es bien sabido, la formación y escisión del enlace disulfuro puede ser reversibles, y la flexibilidad aumenta porque las uniones del péptido se fusionan al extremo amino terminal de la proteína del gen III. Por consiguiente, es importante estabilizar estas estructuras de lazo con residuos adicionales, adyacentes al enlace disulfuro, que favorecen la conformación de lámina beta (R. H. Hoess, Curr. Opin. Struct. Biol. 1993, 3, 572-579) . Este proceso puede no resultar en ligandos de gran afinidad para la diana del receptor. El mismo lazo del péptido se fija a la proteína natural mediante la matriz de la proteína en los extremos C-terminal y N-terminal del lazo y se unen de forma adicional mediante enlaces hidrogeno de las láminas beta antiparalelas inducidas por la matriz natural de la proteína. Se han propuesto otras estrategias, tales como las matrices de péptidos para exponer en giro (A. G. Cochran y otros, J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 625-632) . Otra posible solución a este problema es utilizar uniones estructurales de una proteína plegada para presentar pequeños segmentos variables de péptido (P. A. Nygren y otros, Curr. Opin. Struct. Biol. 1997, 7, 463-469; G. P. Smith y otros,

J. Mol. Biol. 1998, 277, 317-332; A. Christmannn y otros, Protein Eng. 1999, 12, 797-806) .

En realidad, la transferencia de epítopos de proteínas a pequeños péptidos sigue siendo un problema. (A. G. Cochran, Chem. Biol. 2000, 7, R85-R94) .

La presente invención proporciona compuestos con patrones de péptidos, cuya función es la de mantener el lazo del péptido de geometría de horquilla en una conformación estabilizada de horquilla beta. Estos patrones se pueden utilizar para la construir miméticos de lazo de horquilla beta derivados de la exposición en fago para generar bibliotecas de exposición en fago con constantes de unión a dianas muy elevadas.

Esta característica se puede utilizar de forma ventajosa en el cribado de un gran número de bibliotecas de miméticos de lazo de horquilla beta fijados a patrón derivados de exposición en fago, hecho que a su vez facilita considerablemente los estudios de estructura frente a actividad, y por consiguiente el descubrimiento de nuevas moléculas con gran actividad y nuevas selectividades enfocadas a distintos tipos de dianas. Gracias a la arquitectura bien definida a nivel estructural y conformacional de los componentes de la fórmula I, tal y como se describe a continuación, los residuos de aminoácidos clave o motivos contenidos en la cadena Z, codificados en forma de secuencias de ácidos nucleicos en bibliotecas de exposición en fago, se pueden integrar en disposiciones de conformación cerrada. Al desplazar dichos residuos de aminoácidos clave o motivos a lo largo de la estructura de horquilla beta, se pueden analizar nuevas disposiciones de aminoácidos importantes (análisis posicional de secuencias clave) . Alternativamente, se pueden mapear secuencias de proteínas, para detectar los motivos de lazos de horquillas beta. En resumen, esta técnica permite determinar rápidamente aminoácidos clave y motivos (“hotspots”) para la unión en grandes superficies e interfaces de proteínas planas no solo en su disposición secuencial, sino que también en su conformación espacial. Por último, esta información se puede utilizar para diseñar pequeños candidatos a fármacos peptidomiméticos. (B. C. Cunningham, Curr. Opin. Struct Biol. 1997, 7, 457; D. Obrecht y otros, Adv. Med. Chem. 1999, 4, 1-68, JAI Press Inc.) .

Miméticos de lazo de horquilla beta fijados a patrón de la presente invención son componentes de la fórmula R1-CysZ-Cys-R2 (I) , en la que Cys, R1, R2 y Z se definirán a continuación, por ejemplo en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. La presente invención también proporciona una biblioteca de miméticos de horquilla beta fijados a patrón, en la que dicha biblioteca incluye un gran número de componentes de la fórmula I. Esta biblioteca de miméticos de horquilla beta fijados a patrón se puede fusionar, como mínimo, con una parte de una proteína de cubierta fágica, y miméticos de horquilla beta fijados a patrón se observan en la superficie de un fago o de una partícula fagémida.

La biblioteca de la presente invención se define a continuación, por ejemplo en las reivindicaciones 4 ó 5.

Los elementos estructurales que forman los patrones consisten en dos residuos Cys unidos por puentes disulfuro conjuntamente con los residuos R1 y R2, que incluyen cada dos o bien cada tres residuos de aminoácidos, los cuales, tal como se describe a continuación, son capaces de estabilizar la conformación lámina beta y que se colocan en lugares opuestos de las cadenas beta antiparalelas adyacentes al enlace disulfuro; además estos patrones tienen un extremo N-terminal y un extremo C-terminal orientados para enlazarse con la cadena Z. La cadena peptídica Z se une al extremo C-terminal y al extremo N-terminal de los patrones a través de los correspondientes extremos N-y C-terminales... [Seguir leyendo]

1. Compuesto de la fórmula R1-Cys-Z-Cys-R2 (I) , en el cual cada uno de los Cys es un residuo L-cisteína, los dos grupos –SH de los dos residuos L-cisteína se sustituyen por

un grupo -S-S-, R1 y R2 son Glu-Thr y Thr-Lys; o Lys-Thr y Thr-Glu; o Thr-Glu y Lys-Thr; o Thr-Lys y Glu-Thr; o Leu-Glu y Lys-Val; o Val-Lys y Glu-Leu; o Glu-Leu y Val-Lys; o Lys-Leu y Val-Glu; o Glu-Leu-Lys y Glu-Val-Lys; o Lys-Val-Glu y Lys-Leu-Glu; o Leu-Glu-Lys y Glu-Lys-Val; o Val-Lys-Glu y Lys-Glu-Leu; o Glu-Lys-Leu y Val-Glu-Lys; o Lys-Glu-Val y Leu-Lys-Glu; o Lys-Glu-Leu y Val-Lys-Glu; o Glu-Lys-Val y Leu-Glu-Lys, y Z es una cadena de 6 hasta 20 residuos aminoacídicos, siendo cada uno de estos residuos, independientemente, el residuo de un aminoácido L

alfa de origen natural, con la condición, de que Z contenga una de las fracciones -Lys-Trp-Phe-Ser-Asn-His-Tyr-Gln[SEQ ID NO:23]; y -Phe-Leu-Ala-His-Tyr-Ala-[SEQ ID NO:24].

2. Compuesto, según la reivindicación 1, de la fórmula I, en la que R1 y R2 sean Glu-Thr y Thr-Lys; o Leu-Glu y Lys-

Val; o Glu-Leu-Lys y Glu-Val-Lys. 15

3. Compuesto, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, de la fórmula I, en el que R1 y R2 son Glu-Thr y Thr-Lys, y Z is -Lys-Trp-Phe-Leu-Ala-His-Tyr-Ala-; o -Thr-Lys-Trp-Phe-Ser-Asn-His-Tyr-Gln-Thr-; o

-Thr-Lys-Trp-Phe-Leu-Ala-His-Tyr-Ala-Thr-; o -Gly-Thr-Lys-Trp-Phe-Ser-Asn-His-Tyr-Gln-Thr-Gly-, o R1 y R2 son Leu-Glu and Lys-Val, y Z es -Thr-Lys-Trp-Phe-Leu-Ala-His-Tyr-Ala-Thr-,

o R1 y R2 son Glu-Leu-Lys y Glu-Val-Lys, y Z es -Thr-Lys-Trp-Phe-Ser-Asn-His-Tyr-Gln-Thr-.

4. Biblioteca que incluye un gran número de compuestos, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 de la 30 fórmula 1.

5. Biblioteca, según la reivindicación 4, que se caracteriza porque cada uno de los compuestos de la fórmula I se fusiona, como mínimo, con una parte de la cubierta proteica del fago y se expone en la superficie del fago o del fagémido.