Mezclas de enzimas para fermentación.

Una composición que comprende:

(i) una glucoamilasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 1;

(ii) una alfa amilasa estable a los ácidos que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 5; y

(iii) una proteasa fúngica ácida que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 14,

en la que la relación de la glucoamilasa, la alfa amilasa estable a los ácidos y la proteasa fúngica ácida es de 1:1,5:0,1 a 1:8:1, como se mide por GAU:SSU:SAPU,

y en la que GAU representa una unidad glucoamilasa, SSU representa una unidad almidón soluble y SAPU representa una unidad proteasa ácida espectrofotométrica.

Mezclas de enzimas para fermentación

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención hace referencia a una mezcla de enzimas que comprende una glucoamilasa, una alfa amilasa estable a los ácidos, y una proteasa fúngica ácida. La presente invención también hace referencia a métodos para utilizar la mezcla de enzimas en procesos de conversión de almidón, por ejemplo, tales como para producir productos finales tales como etanol.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La fermentación industrial utiliza predominantemente glucosa como materia prima para la producción de una gran cantidad de productos finales tales como enzimas, proteínas, aminoácidos, ácidos orgánicos, polialcoholes, productos farmacéuticos y otros productos bioquímicos. En muchas aplicaciones la glucosa se produce a partir de la conversión enzimática de sustratos que comprenden almidón y celulosa (por ejemplo, granos de cereal molido enteros) . El almidón, que comprende dos fracciones de polisacáridos, amilosa y amilopectina, se deposita en células vegetales como partículas granuladas. La estructura cristalina parcial de estos gránulos confiere insolubilidad en agua fría, y, como resultado, la solubilización de los gránulos de almidón en agua generalmente requiere energía calorífica para romper la estructura cristalina del gránulo. Se han empleado numerosos procesos para la solubilización del almidón y estos incluyen el calentamiento directo e indirecto de sustratos que comprenden almidón granulado. (Véase, por ejemplo, STARCH CHEMISTRY AND TECHNOLOGY, Eds R.L. Whistler et al., 2ª Ed., 1984 Academic Press Inc., Orlando FL y STARCH

CONVERSION TECHNOLOGY, Eds G.M.A. Van Beynum et al., Food Science and Technology Series 1985 Marcel Dekker Inc. NY) .

El procesamiento de almidón a glucosa normalmente consiste en dos etapas, y estas etapas incluyen la licuefacción del almidón y la sacarificación del almidón licuificado. Etapas adicionales pueden incluir (a) la purificación y la isomerización cuando el producto final deseado es una fructosa o dextrosa purificada o (b) la fermentación y la destilación cuando el producto final deseado es, por ejemplo, un alcohol (por ejemplo, etanol) .

Un objetivo del proceso de licuefacción del almidón es convertir una suspensión de gránulos de polímero de almidón en una solución de dextrinas de longitud de cadena más corta de baja viscosidad. Ésta es una etapa importante para manipular de forma conveniente el equipo industrial utilizado en los procesos de conversión del almidón. Normalmente, el almidón se licuifica utilizando temperatura elevada y bioconversión enzimática. Por 30 ejemplo, un proceso de licuefacción enzimática común implica añadir una alfa amilasa bacteriana termoestable (por ejemplo, SPEZYME® PRIME y SPEZYME® FRED, SPEZYME® ETHYL (Danisco U.S., Inc, Genencor Division) o TERMAMYL SC, TERMAMYL SUPRA o TERMANYL 120L (Novozymes) ) a una suspensión que comprende un sustrato que incluye almidón y ajustar el pH a entre 5.5 y 6.5 y la temperatura a más de 90 º C. El almidón se licuifica y después se somete a enzimas de sacarificación. Normalmente, la sacarificación tiene lugar

en presencia de enzimas de glucoamilasa tales como glucoamilasa de Aspergillus niger (por ejemplo, OPTIDEX L-400 (Genencor International Inc.) ) con un pH más ácido que el pH de la etapa de licuefacción.

US 2006/003408 describe alfa amilasas estables a los ácidos que tienen actividad de hidrólisis de almidón granulado y composiciones enzimáticas.

WO 2004/080923 describe procesos para la producción de un producto de alcohol a partir de almidón granulado que comprende un pretratamiento a una temperatura elevada por debajo de la temperatura de gelatinización inicial de dicho almidón granular seguido de la sacarificación y fermentación simultánea, y opcionalmente de la recuperación del etanol.

WO 02/074895 describe un proceso para producir un producto de fermentación, en concreto etanol; una composición que comprende al menos una actividad enzimática que genera una fuente de carbohidratos y al

menos una actividad de alfa-amilasa y/o una o varias enzimas de degradación de la pared celular de la levadura, tales como una preparación de enzimas a partir de Trichoderma y la utilización de la composición para la producción de un producto de sacarificación y/o fermentación, en concreto, etanol.

WO 2006/060062 describe la glucoamilasa de Trichoderma reesei y homólogos de la misma. Las glucoamilasas son útiles para la producción de glucosa y otros productos finales a partir del almidón. Las 50 glucoamilasas son adecuadas para utilizarse en diferentes procesos y son especialmente adecuadas para utilizarse bajo condiciones de procesamiento de almidón convencional a alta temperatura y bajo condiciones de procesamiento de almidón sin cocción o a baja temperatura.

WO 2006/073839 describe proteasas fúngicas ácidas, designadas proteasas de la familia NSR24, proteasas de la familia NSP25 y proteasas PepA; polipéptidos de proteasa de las familias NSP24 y NS’P25;

también se describen composiciones que incluyen dichas proteasas y usos de las mismas.

Existen un número de variaciones para la licuefacción y la sacarificación de un sustrato de almidón. No obstante, se necesitan medios más eficientes para la licuefacción, la sacarificación y la fermentación del almidón.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una composición de mezcla de enzimas como se define en la 5 reivindicación 1.

La composición de mezcla de enzimas es útil para producir productos finales a partir de azúcares fermentables, especialmente para producir etanol a partir de un licuado. Una ventaja de la composición de mezcla de enzimas es que da como resultado una mayor cantidad de etanol en relación con la cantidad de etanol producida por la glucoamilasa sola bajo esencialmente las mismas condiciones. En un aspecto, el aumento es mayor que 0, 5 % en relación con la GA sola, incluyendo un aumento mayor que 1, 0 %, 1, 5 %, 2 % y 2, 5 %.

La glucoamilasa tiene al menos 95 % de identidad de secuencia, teniendo la glucoamilasa la secuencia de la SEQ ID Nº 1; y la proteasa fúngica ácida (AFP, por sus siglas en inglés) tiene al menos 95 % de identidad de secuencia, teniendo la AFP la secuencia de la SEQ ID Nº 14, y la alfa amilasa tiene al menos 95 % de identidad de secuencia, teniendo la AA la secuencia de la SEQ ID Nº 5. La relación de la glucoamilasa, la alfa amilasa estable a los ácidos y la proteasa fúngica ácida es la que se define en la reivindicación 1.

La composición de mezcla de enzimas incluye opcionalmente una o varias enzimas, tales como una segunda glucoamilasa, una segunda alfa amilasa, una celulasa, una hemicelulasa, una xilanasa, una segunda proteasa, una fitasa, una pululanasa, una beta amilasa, una lipasa, una cutinasa, una pectinasa, una betaglucanasa, una galactosidasa, una esterasa, una ciclodextrina transglicosiltransferasa, y combinaciones de las mismas.

La presente invención se refiere además a un método para producir productos finales tales como un alcohol a partir de azúcares fermentables. El método es el que se define en la reivindicación 7. El método también puede incluir una etapa de recuperación de los productos finales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra las concentraciones finales de alcohol obtenidas utilizando diferentes mezclas de enzimas durante la sacarificación/fermentación simultánea utilizando maíz molido entero que ha sido licuificado como se describe adicionalmente en el Ejemplo 2. El eje Y es el % de etanol (V/V) , el eje X es como sigue: 1. TrGA, 0, 25 GAU/gds (gramos de residuo seco) de maíz, 2. #1 + 0, 05 SAPU AFP/gds de maíz, 3. #1 + 2, 0 SSU de alfa amilasa/gds de maíz, 4. Nº 1 + 0, 05 SAPU, AFP +2, 0 SSU de alfa amilasa/gds de maíz.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Definiciones [0017] A menos que se defina de otra manera en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado comúnmente entendido por un experto habitual en la materia al cual pertenece esta invención. Singleton, et al., DICTIONARY OF

MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2ª ED., John Wiley and Sons, Nueva York (1994) , y Hale & Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) proporcionan a un experto en la material el significado general de muchos de los términos utilizados en el presente documento. Aún así, algunos términos se definen a continuación con motivo de obtener claridad y facilidad de referencia.

“Alfa... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende:

(i) una glucoamilasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 1;

(ii) una alfa amilasa estable a los ácidos que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 5; y

(iii) una proteasa fúngica ácida que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 14,

en la que la relación de la glucoamilasa, la alfa amilasa estable a los ácidos y la proteasa fúngica ácida es de 1:1, 5:0, 1 a 1:8:1, como se mide por GAU:SSU:SAPU, y en la que GAU representa una unidad glucoamilasa, SSU representa una unidad almidón soluble y SAPU representa una unidad proteasa ácida espectrofotométrica.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que la relación de la glucoamilasa, la alfa amilasa estable a los ácidos y la proteasa fúngica ácida es de 1:2:0, 2 a 1:5:0, 6, como se mide por GAU:SSU:SAPU.

3. Composición según la reivindicación 1, en la que la glucoamilasa comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 1.

4. Composición según la reivindicación 1, en la que la alfa amilasa estable a los ácidos comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 5.

5. Composición según la reivindicación 1, en la que la proteasa fúngica ácida comprende la secuencia de 20 aminoácidos de la SEQ ID Nº 14.

6. Composición según la reivindicación 1, que comprende además una enzima adicional seleccionada del grupo consistente en: una segunda glucoamilasa, una segunda alfa amilasa, una celulasa, una hemicelulasa, una xilanasa, una segunda proteasa, una fitasa, una pululanasa, una beta amilasa, una lipasa, una cutinasa, una pectinasa, una beta-glucanasa, una galactosidasa, una esterasa, una ciclodextrina transglicosiltransferasa, y

combinaciones de las mismas.

7. Método para producir productos finales a partir de azúcares fermentables, que comprende las etapas consistentes en:

a) poner en contacto una suspensión que comprende un grano molido que contiene almidón con una alfa amilasa para producir un licuado;

b) poner en contacto el licuado con una composición como se define en la reivindicación 1, para producir azúcares fermentables; y c) fermentar los azúcares fermentables en presencia de un organismo de fermentación para producir productos finales.

8. Método según la reivindicación 7, en el que dicho producto final es alcohol.

9. Método según la reivindicación 7, en el que la relación de la glucoamilasa, la alfa amilasa estable a los ácidos y la proteasa fúngica ácida es de 1:2:0, 2 a 1:5:0, 6, como se mide por GAU:SSU:SAPU.

10. Método según la reivindicación 7, en el que las etapas (b) y (c) se producen secuencialmente.

11. Método según la reivindicación 7, en el que las etapas (b) y (c) se producen simultáneamente.

12. Método según la reivindicación 7, en el que la etapa (b) se lleva a cabo a 30 º C-65 º C y a un pH de 3.0-5.0.

13. Método según la reivindicación 7, en el que la etapa (c) se lleva a cabo a 15 º C-40 º C y a un pH de 3.0-6.5.