Proteasa coagulante de la leche de tipo mejorado derivada de un microorganismo.

Una proteasa de tipo mejorado que comprende una secuencia aminoacídica que es al menos un 75 % idéntica ala SEC.

ID. Nº 3, dicha proteasa de tipo mejorado tiene al menos una mutación seleccionada de entre el grupo queconsiste en:

(A) sustitución de la glutamina correspondiente a la glutamina en la posición 265 de la SEC ID Nº 3 con unaminoácido ácido; y

(B) sustitución de la glutamina en la posición 266 de la SEC ID Nº 3 con un aminoácido acido, y en la que dichaproteasa de tipo mejorado tiene actividad coagulante de la leche.

Proteasa coagulante de la leche de tipo mejorado derivada de un microorganismo

Campo de la técnica La presente invención se refiere a una proteasa que tiene una actividad coagulante de la leche mejorada derivada de un microorganismo. La proteasa se utiliza preferentemente para la producción de queso.

Técnica antecedente Durante muchos años se ha utilizado el cuajo de ternero como enzima coagulante de la leche para la producción de queso. La actividad coagulante de la leche del cuajo de ternero se atribuye principalmente a la quimosina, que es una proteasa ácida y que tiene una actividad proteasa específica del sitio para la caseína de la leche con una baja actividad no específica del sitio (digiere específicamente la unión peptídica entre fenilalanina en la posición 105 y metionina en la posición 106 en la secuencia aminoacídica de la κ-caseína) . La actividad proteasa no específica se cree que da lugar a la reducción en el rendimiento de la producción de leche y a generar un péptido de sabor amargo durante la maduración. Por esta razón, la quimosina es una enzima coagulante de la leche excelente.

Sin embargo, el descenso de la matanza de terneros y el aumento de la demanda de queso han hecho que sea difícil el suministro de cuajo de ternero. Hoy día, se utiliza ampliamente como enzima coagulante de la leche una enzima coagulante de la leche derivada de microorganismos tales como Rhizomucor miehei y Rhizomucor pusillus, y una quimosina recombinante producida por la introducción del gen de la quimosina de ternero en hongos o levaduras.

La enzima coagulante de la leche mencionada anteriormente derivada de un microorganismo, cuando se compara con la quimosina de ternero o la quimosina recombinante, tiene una actividad proteasa no específica más alta. Es un problema cuando la relación C/P (relación entre actividad de coagulación láctea con respecto a la actividad proteasa) , que es una importante característica de la enzima de coagulación láctea, es baja. Con el fin de resolver este problema, se expresó y se evaluó una variante del gen de la enzima que coagula la leche en Rhizomucor pusillus, obtenida por mutagénesis dirigida al sitio por manipulación genética. En la variante, la relación C/P se mejoró para que fuera mejor que el tipo silvestre sustituyendo el ácido glutámico de la posición 19 con alanina en la secuencia aminoacídica de la enzima coagulante de la leche (Documento No patente 1) .

Sin embargo, aunque la actividad coagulante de la leche de la enzima coagulante de la leche desciende aproximadamente en un 40 % con la sustitución de aminoácidos, era difícil poner dicha enzima en una aplicación práctica. Por tanto, se desea una enzima coagulante de la leche derivada de un microorganismo en la que la relación C/P sea alta y la actividad coagulante de la leche se mantenga o se mejore.

Además, se ha intentado la acilación de la enzima coagulante de la leche derivada de microorganismos tales como Rhizomucor pusillus y Rhizomucor miehei con anhídrido dicarboxílico con el fin de mejorar la relación C/P. (Documento patente 1) . Con este procedimiento, se obtuvo alguna mejoría, sin embargo no es aún satisfactorio.

[Documento Patente 1] Patente Japonesa Nº 3-18834B

[Documento No Patente 1] J. Biochem. 129, 791-794, 2001

Sumario de la Invención Un objetivo de la presente invención es proporcionar una proteasa adecuada para la coagulación láctea en la que la actividad (a partir de ahora denominada “actividad proteasa no específica”) para digerir un enlace peptídico distinto del enlace entre fenilalanina en la posición105 y metionina en la posición 106 de la secuencia aminoacídica de la κcaseína es baja, y se mantiene o mejora la actividad coagulante de la leche.

Los inventores de la presente invención han estudiado intensamente para superar el problema descrito anteriormente, y aislaron, entre las cepas mutantes de microorganismos que producen una enzima coagulante de la leche, una cepa mutante que produce una enzima coagulante de la leche en la que la relación C/P está mejorada debido a la reducción de la actividad proteasa no específica; aislaron un gen de la enzima coagulante de la leche de tipo mejorado; determinaron la secuencia de nucleótidos del mismo; expresaron el gen: y midieron la actividad coagulante de la leche y la relación C/P de la enzima coagulante de la leche de tipo mejorado, completando de esta manera la presente invención.

En consecuencia, la presente invención proporciona una proteasa derivada de los microorganismos que tienen una actividad coagulante de la leche, cuya actividad coagulante de la leche se mantiene o está aumentada y la relación 65 C/P está aumentada, también proporciona un ADN que codifica esa proteasa, un vector que contiene el ADN y una célula transformada en la que se ha introducido el vector.

Un aspecto de la presente invención es proporcionar una proteasa de tipo mejorado que comprende una secuencia aminoacídica que es al menos un 75 % idéntica a la SEC ID Nº 3, dicha proteasa de tipo mejorado tiene al menos una mutación seleccionada de entre el grupo que consiste en:

(A) sustitución de la glutamina correspondiente a la glutamina en la posición 265 de la SEC ID Nº 3 con un aminoácido ácido; y

(B) sustitución de la glutamina en la posición 266 de la SEC ID Nº 3 con un aminoácido ácido, y en el que dicha proteasa de tipo mejorado tiene actividad coagulante de la leche.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar la proteasa de tipo mejorado como se describió anteriormente, la cual se selecciona de entre el grupo que consiste en:

(A) una proteína que comprende la secuencia aminoacídica SEC ID Nº 3 o 43 excepto por que la glutamina en la posición 265 y/o la glutamina en la posición 266 se ha (n) sustituido con un aminoácido ácido.

(B) una proteína que comprende la secuencia aminoacídica de la SEC ID Nº 3 o 43 excepto por que la glutamina en la posición 265 y/o la glutamina en la posición 266 se ha (n) sustituido con un aminoácido ácido y no más de 10 aminoácidos (preferentemente no más de 5 aminoácidos, más preferentemente no más de 3 aminoácidos, más preferentemente no más de 2 aminoácidos) en posiciones distintas de 265 y 266 se han sustituido, borrado, insertado o añadido, y en el que dicha proteasa de tipo mejorado tiene actividad coagulante de la leche.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar la proteasa de tipo mejorado como se ha descrito anteriormente, en el que dicho aminoácido ácido es ácido glutámico o ácido aspártico. Otro aspecto de la presente invención es proporcionar la proteasa de tipo mejorado que se ha descrito anteriormente, en la que el ácido glutámico de la posición 19 se sustituye con valina, alanina, isoleucina o leucina.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar la proteasa de tipo mejorado que se ha descrito anteriormente, en la que la treonina de la posición 81 se ha sustituido con glutamina o ácido aspártico. Un aspecto más de la presente invención es proporcionar un ADN que codifica la proteasa de tipo mejorado que se ha descrito anteriormente. Un aspecto más de la presente invención es proporcionar un vector de expresión que comprende el ADN que se ha descrito anteriormente. Un aspecto más de la presente invención es proporcionar una célula transformada en la que se ha introducido el vector de expresión descrito anteriormente. Un aspecto más de la presente invención es proporcionar la células transformada que se ha descrito anteriormente, siendo dicha célula transformada Saccharomyces cerevisiae.

Un aspecto más de la presente invención es proporcionar un procedimiento para producir una proteasa de tipo mejorado que tiene una actividad coagulante de la leche, que comprende las etapas de cultivo de la célula transformada que se ha descrito anteriormente en un medio de cultivo y la recolección de la proteasa del tipo mejorado en el medio de cultivo.

Como la actividad coagulante de la leche se mantiene o se mejora y la relación C/P es alta, se espera que el rendimiento de producción de queso sea más alto con la enzima de tipo mejorado de la presente invención. Además, generalmente una relación C/P más alta implica que el desarrollo de sabor amargo en el queso durante la maduración se reduce, es decir se puede fabricar queso de alta calidad con la enzima mejorada.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 muestra la estructura de un vector de expresión JS4.

La Figura 2 muestra el alineamiento de la secuencia de la proteasa proveniente de Rhizomucor pusillus (RMPP) y la proteasa proveniente de Rhizomucor miehei (RMMP) .

Descripción... [Seguir leyendo]

1. Una proteasa de tipo mejorado que comprende una secuencia aminoacídica que es al menos un 75 % idéntica a la SEC. ID. Nº 3, dicha proteasa de tipo mejorado tiene al menos una mutación seleccionada de entre el grupo que 5 consiste en:

(A) sustitución de la glutamina correspondiente a la glutamina en la posición 265 de la SEC ID Nº 3 con un aminoácido ácido; y

(B) sustitución de la glutamina en la posición 266 de la SEC ID Nº 3 con un aminoácido acido, y en la que dicha 10 proteasa de tipo mejorado tiene actividad coagulante de la leche.

2. La proteasa de tipo mejorado de acuerdo con la reivindicación 1, que se selecciona de entre el grupo que consiste en:

(A) una proteína que comprende la secuencia aminoacídica SEC ID Nº 3 o 43 excepto por que la glutamina en la posición 265 y/o la glutamina en la posición 266 se ha (n) sustituido con un aminoácido ácido.

(B) una proteína que comprende la secuencia aminoacídica SEC ID Nº 3 o 43 excepto por que la glutamina en la posición 265 y/o la glutamina en la posición 266 se ha (n) sustituido con un aminoácido ácido y no más de 10 aminoácidos en posiciones distintas de 265 y 266 se han sustituido, delecionado, insertado o añadido, y en la que dicha proteasa de tipo mejorado tiene actividad coagulante de la leche.

3. La proteasa de tipo mejorado de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que dicho aminoácido ácido es ácido glutámico o ácido aspártico.

4. La proteasa de tipo mejorado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el ácido glutámico en la posición 19 se sustituye con valina, alanina, isoleucina o leucina.

5. La proteasa de tipo mejorado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la treonina en la posición 81 se sustituye con glutamina o ácido aspártico. 30

6. Un ADN que codifica la proteasa de tipo mejorado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un vector de expresión que comprende el ADN de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Una célula transformada distinta de una célula humana en la que se introduce el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Una célula transformada de acuerdo con la reivindicación 8 que es una célula de levadura, una célula fúngica o una célula vegetal. 40

10. La célula transformada de acuerdo con la reivindicación 8, siendo dicha célula transformada Saccharomyces cerevisiae.

11. Un procedimiento para producir una proteasa de tipo mejorado que tiene actividad coagulante de la leche, que

comprende las etapas de cultivo de la célula transformada de acuerdo con la reivindicación 8, 9 o 10 en un medio de cultivo y la recolección de la proteasa de tipo mejorado en el medio de cultivo.