PROTEASAS.
Polipéptido aislado que tiene actividad de proteasa y que tiene una actividad específica en hemoglobina a pH 7,
5 y 25ºC de al menos 41 AU/g, midiéndose la actividad de proteasa en unidades AU usando el ensayo EB-SM-0349 02/01 del ejemplo 7, donde el polipéptido es seleccionado del grupo que consiste en:
(a) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad a los aminoácidos 1 a 188 de la SEC ID nº: 2 de al menos un 65%; y/o
(b) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que tiene un grado de identidad a los nucleótidos 502-1065 de la SEC ID nº: 1 de un 74% como mínimo
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/DK2004/000433.
Solicitante: NOVOZYMES A/S.
Nacionalidad solicitante: Dinamarca.
Dirección: KROGSHØJVEJ 36,2880 BAGSVAERD.
Inventor/es: OSTERGAARD, PETER RAHBEK, LASSEN,SOREN,FLENSTED, SJOHOLM,CARSTEN.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 26 de Mayo de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N9/52 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › que provienen de bacterias.
- C12N9/58 C12N 9/00 […] › que provienen de hongos.
Clasificación PCT:
- A23J3/34 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A23 ALIMENTOS O PRODUCTOS ALIMENTICIOS; SU TRATAMIENTO, NO CUBIERTO POR OTRAS CLASES. › A23J COMPOSICIONES A BASE DE PROTEINAS PARA LA ALIMENTACION; TRATAMIENTO DE PROTEINAS PARA LA ALIMENTACION; COMPOSICIONES A BASE DE FOSFATIDOS PARA LA ALIMENTACION. › A23J 3/00 Tratamiento de proteínas para la alimentación. › utilizando enzimas.
- C12N15/57 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › que actúan sobre los enlaces peptídicos (3.4).
- C12N9/52 C12N 9/00 […] › que provienen de bacterias.
- C12N9/58 C12N 9/00 […] › que provienen de hongos.
Clasificación antigua:
Fragmento de la descripción:
Proteasas.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad de proteasa y que es homólogo a las proteasas de Nocardiopsis, al igual que a secuencias de ácidos nucleicos aisladas que lo codifican. La invención se refiere además a constructos de ácidos nucleicos, vectores y células huéspedes, incluidas las plantas transgénicas y animales no humanos, que comprenden estas secuencias de ácidos nucleicos, al igual que a métodos para producir y usar la proteasa, en particular en piensos para animales.
La proteasa de la invención tiene una alta actividad específica. Se describen características estructurales propias de relevancia para la actividad específica alta de las proteasas de la familia de la peptidasa S2A o S1E.
Antecedentes de la invención
Las proteasas derivadas de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 y Nocardiopsis dassonvillei NRRL 18133 se describen en WO 88/03947. El ADN y las secuencias de aminoácidos de la proteasa derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 se muestran en la solicitud DK nº 1996 00013. WO 01/58276 describe el uso en piensos para animales de proteasas estables en ácido relacionadas con la proteasa derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 y una proteasa derivada de Nocardiopsis alba DSM 14010. No obstante, estas proteasas tienen una actividad específica baja.
JP 2-255081-A describe una proteasa derivada de la cepa de Nocardiopsis sp. OPC-210 (FERM P-10508), no obstante, sin información de secuencia. La cepa ya no está disponible, puesto que el depósito fue retirado.
DD 200432|8 expone una preparación proteolítica derivada de la cepa Nocardiopsis dassonvillei ZIMET 43647, no obstante, sin información de secuencia. La cepa parece ya no estar disponible.
JP 2003284571-A, publicada después de la primera fecha de presentación de la presente invención, expone la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN correspondiente de una proteasa derivada de Nocardiopsis sp. TOA-1 (FERM P-18676). La secuencia se ha introducido en GENESEQP con nº ADF43564.
La proteasa de la técnica anterior más homologa que no es una proteasa de Nocardiopsis es Sapll_Streptomyces_ sp_sptrembl_q55353, la parte madura de la cual tiene una identidad de aminoácido de 61,5% y 63,5%, respectivamente, a las partes maduras de la SEC ID nº: 2 y 6, respectivamente. Las identidades de ADN correspondientes son 70,3% y 72,7%, a SEC ID nº: 1 y 5, respectivamente. La parte madura de una proteasa de Streptomyces relacionada, es decir, Sapll_Streptomyces_sp_sptrembl_q55352, tiene un porcentaje de identidad ligeramente más alto a la parte madura de SEC ID nº: 1, es decir, 70,8%.
Es un objeto de la presente invención proporcionar proteasas de una actividad específica alta homologa a proteasas de Nocardiopsis, en particular con potencial para el uso en piensos para animales y/o en detergentes.
Resumen de la invención
Las proteasas de alta actividad específica fueron aisladas y caracterizadas, es decir, una proteasa derivada de Nocardiopsis alba DSM 15647 (véase SEC ID nº: 1 y 2), y una proteasa derivada de Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235 (véase SEC ID nº: 5 y 6).
En un primer aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad de proteasa y que tiene actividad específica en hemoglobina a pH 7,5 y 25ºC de 41 AU/g como mínimo. La actividad de proteasa en unidades AL) se mide usando el ensayo EB-SM-0349 02/01 del ejemplo 7, donde el polipéptido es seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad a los aminoácidos 1 a 188 de la SEC ID nº: 2, de al menos un 65%; y/o (b) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que tiene un grado de identidad a los nucleótidos 502-1065 de la SEC ID nº: 1, de al menos un 74%. La invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican esas proteasas; constructos de ácidos nucleicos, vectores y células huéspedes que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos; al igual que métodos para producir y usar las proteasas, en particular, en piensos para animales.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a un polipéptido que
Los polipéptidos aislados según se describen más abajo para información estarían comprendidos en la invención
Reivindicaciones:
1. Polipéptido aislado que tiene actividad de proteasa y que tiene una actividad específica en hemoglobina a pH 7, 5 y 25ºC de al menos 41 AU/g, midiéndose la actividad de proteasa en unidades AU usando el ensayo EB-SM-0349 02/01 del ejemplo 7, donde el polipéptido es seleccionado del grupo que consiste en:
2. Polipéptido según la reivindicación 1 que
3. Secuencia de ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2.
4. Secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 3 que
5. Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 3-4 operativamente vinculada a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuado.
6. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 5.
7. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 5 o el vector según la reivindicación 6.
8. Método para la producción de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, el método comprendiendo: (a) cultivo de una célula huésped recombinante según la reivindicación 8 para producir un sobrenadante que comprende el polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.
9. Planta transgénica, o parte de planta, que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 5 o el vector según la reivindicación 6 y es capaz de expresar el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2.
10. Animal transgénico no humano, o productos, o elementos del mismo, que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 5 o el vector según la reivindicación 6 y que es capaz de expresar el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2.
11. Método para la producción de un polipéptido según la reivindicación 1, el método comprendiendo
12. Uso de al menos un polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 (i) en pienso para animales; (ii) en la preparación de una composición para el uso en pienso para animales; (iii) para mejorar el valor nutritivo de un pienso para animales; (iv) para aumentar la proteína digerible y/o soluble en dietas para animales; (v) para aumentar el grado de hidrólisis de proteínas en dietas para animales; y/o (vi) para el tratamiento de proteínas.
13. Aditivo de pienso para animales que comprende al menos un polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2; y
14. Composición de pienso para animales con un contenido de proteína bruta de 50 a 800 g/kg y que comprende al menos un polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1ª y 2ª, o al menos un aditivo de alimento para animal según la 13ª reivindicación.
15. Composición que comprende al menos un polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, junto con al menos otra enzima seleccionada entre amilasa, fitasa, xilanasa, galactanasa, alfa-galactosidasa, proteasa, fosfolipasa y/o beta-glucanasa.
16. Uso de al menos un polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 en detergentes.
17. Nocardiopsis alba DSM 15647.
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