Método para generar un ratón homocigótico para una modificación genética.

Un método para generar un embrión de ratón que comprende células que son homocigóticas para una modificación genética,

que comprende:

(a) introducir células donantes de ratón en un embrión huésped en pre-mórula, en donde las células donantes comprenden células ES o células tipo ES de un ratón endógamo, y que son homocigóticas para la modificación genética; y

(b) cultivar el embrión huésped en pre-mórula de (a) hasta el estadío de blastocisto en donde al menos el 90 % de las células de un ratón que se desarrolla a partir del blastocisto se derivan de las células donantes.

Método para generar un ratón homocigótico para una modificación genética Antecedentes Campo de la invención La invención se dirige a métodos mejorados para generar un ratón homocigótico o heterocigótico para una modificación genética. Más específicamente, la presente invención se dirige a métodos para aumentar la eficiencia de generación de ratones capaces de transmitir una modificación deseada a su descendencia posterior, para generar ratones que tienen una alta contribución de material genético de células donantes, y para aumentar la eficiencia y disminuir el tiempo necesario para generar ratones homocigóticos o heterocigóticos que porten la modificación genética deseada.

Descripción de la técnica relacionada Se conocen en la técnica métodos para modificar células donantes eucarióticas. Véase, por ejemplo la Patente de los Estados Unidos Nº 6.586.251. También se conocen en la técnica métodos para generar animales transgénicos.

En Yagi et al. (1993) Analytical Biochemistr y 214: 70-76 se describe un método propuesto para mejorar la eficiencia en la generación de animales capaces de transmitir una modificación deseada en células ES TT2.

Breve sumario de la invención La invención se refiere exclusivamente a la modificación genética de ratones. La invención se basa en parte en la realización de que la introducción de una célula modificada en un embrión huésped en estadío temprano aumenta sustancialmente el material genético y la contribución celular de las células donantes al embrión huésped, de tal forma que el animal producido tiene una fracción incrementada de células del donante y por tanto tienen una probabilidad aumentada de transmitir la modificación a través de la línea germinal. Además, los métodos de la invención permiten emplear un intervalo más amplio de células donantes de lo que se practicaba con los métodos de la técnica anterior. Los métodos de la presente invención por tanto reducen el número de animales y cruzamientos necesarios para generar un animal homocigótico para una modificación.

La presente invención proporciona un método para generar un embrión de ratón que comprende células que son 35 homocigóticas para una modificación genética, que comprende:

(a) introducir células donantes de ratón en un embrión huésped de ratón en pre-mórula, en donde las células donantes son células ES o células tipo ES procedentes de un ratón endogámico, y que son homocigóticas para la mutación genética; y

(b) cultivar el embrión huésped en pre-mórula de (a) hasta el estadío de blastocisto.

en donde al menos un 90 % de las células de un ratón que se desarrolla a partir del blastocisto se derivan de las células donantes.

El método anterior de la invención puede comprender además introducir el embrión de (b) en una madre ratón subrogada para la gestación.

La presente invención también proporciona un método para generar un embrión de ratón que comprende células que son heterocigóticas para una modificación genética, que comprende:

(a) introducir células donantes de ratón en un embrión huésped de ratón en pre-mórula, en donde las células donantes de ratón son células ES o células tipo ES procedentes de un ratón endogámico, y que son heterocigóticas para la modificación genética; y

(b) cultivar el embrión huésped en pre-mórula de (a) hasta el estadío de blastocisto,

en donde al menos el 90 % de las células de un ratón que se desarrolla a partir del blastocisto se derivan de las células donantes.

El método anterior de la invención puede comprender además gestar el embrión de (b) en una madre ratón 60 subrogada.

La presente invención además proporciona un embrión de ratón en pre-mórula que comprende células donantes de ratón introducidas bajo la zona pelúcida, en donde las células donantes comprenden células ES o células tipo ES procedentes de un ratón endogámico que son heterocigóticas u homocigóticas para una modificación genética.

Los métodos anteriores de la invención pueden además comprender la gestación del embrión de ratón modificado genéticamente para generar un embrión de ratón modificado genéticamente para generar un ratón modificado genéticamente. En los casos donde las células donantes son homocigóticas para la modificación genética, al menos un 90 % de las células en el ratón modificado genéticamente son homocigóticas para la modificación genética. En los casos donde las células donantes son heterocigóticas para la modificación genética, al menos un 90 % de las células en el ratón modificado genéticamente son heterocigóticas para la modificación genética.

Además se describe en el presente documento un método para generar un mamífero no humano modificado, que comprende: (a) introducir una célula donante eucariótica en un embrión en estadío temprano; y (b) introducir el embrión de (a) en una madre subrogada para la gestación, en donde se genera un mamífero no humano modificado.

El embrión en estadío temprano empleado en los métodos de la invención es un embrión en estadío pre-mórula. En una realización más específica, el embrión en estadío temprano es un embrión de 8 células. El embrión en estadío temprano puede derivarse de cualquier cepa. En una realización, se emplea un embrión endogámico, por ejemplo C57BL/6, como embrión huésped. En otra realización, se emplea un embrión exógamo, por ejemplo Swiss Webster, como embrión huésped.

La célula donante eucariótica es una célula madre. Más específicamente, la célula madre es una célula madre embrionaria (ES) o una célula de tipo ES. Pueden emplearse células ES de cualquier línea celular ES adecuadas en el método de la invención. En una realización, la célula ES se deriva de una cepa endogámica, por ejemplo, 129, C57BL/6 o BalbC. En otra realización, la célula ES se deriva de una cepa híbrida, por ejemplo, C57BL/6 x 129. En una realización específica, la célula es una célula ES de ratón. Los métodos descritos en el presente documento pueden practicarse con células derivadas de otros mamíferos no humanos, por ejemplo, una célula ES o tipo ES de rata. En una realización, la célula ES o tipo ES es una célula modificada que comprende una modificación genética. En una realización más específica, la modificación puede surgir espontáneamente, puede ser al azar, puede ser el resultado de una manipulación experimental, por ejemplo, mediante la introducción de un ácido nucléico exógeno. Se puede introducir un ácido nucléico exógeno mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, por recombinación homóloga.

Adicionalmente, en el presente documento se describe un método para generar un mamífero no humano homocigótico para una modificación genética, que comprende: (a) introducir una célula femenina donante eucariótica en un embrión huésped en estadío temprano, en donde la célula donante eucariótica es heterocigótica para la modificación genética; (b) mantener al embrión de (a) en cultivo para desarrollo posterior; (c) introducir al embrión de (b) en una madre subrogada para la gestación, en donde se genera un mamífero hembra modificado; (a') introducir una célula masculina donante eucariótica en un embrión huésped en estadío temprano, en donde la célula donante es heterocigótica para la modificación genética; (b') mantener al embrión de (a') en cultivo para desarrollo posterior; (c') introducir el embrión de (b') en una madre subrogada para la gestación, en donde se genera un mamífero macho modificado; y (d) cruzar al macho y hembra sexualmente maduros de (c y c') , en donde se genera un mamífero no humano homocigótico para la modificación genética.

En una realización, la célula femenina donante eucariótica de la etapa (a) se deriva de la misma línea celular que la célula masculina donante eucariótica de la etapa (a') . En una realización más específica, la célula femenina donante eucariótica de la etapa (a) es una célula XO y el mamífero hembra modificado de la etapa (c) es un ratón XO.

La célula donante eucariótica masculina o femenina es una célula madre, preferentemente una célula ES o tipo ES heterocigótica. En una realización, la célula ES heterocigótica se genera mediante (i) la obtención de un fragmento genómico elongado clonado que contiene una secuencia de interés de ADN; (ii) el uso de recombinación homóloga bacteriana para modificar genéticamente el fragmento genómico elongado clonado de (i) para crear un vector de elongación orientado para usarlo en células eucarióticas donantes (LTVEC, o vector de elongación orientado) ; (iii)... [Seguir leyendo]

1. Un método para generar un embrión de ratón que comprende células que son homocigóticas para una modificación genética, que comprende:

(a) introducir células donantes de ratón en un embrión huésped en pre-mórula, en donde las células donantes comprenden células ES o células tipo ES de un ratón endógamo, y que son homocigóticas para la modificación genética; y

(b) cultivar el embrión huésped en pre-mórula de (a) hasta el estadío de blastocisto en donde al menos el 90 % de las células de un ratón que se desarrolla a partir del blastocisto se derivan de las células donantes.

2. El método de la reivindicación 1, que además comprende introducir el embrión de (b) en una madre ratón subrogada para la gestación.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde las células donantes de ratón homocigóticas para la modificación genética se generan mediante un proceso seleccionado de el grupo que consiste en conversión génica, dirigir ambos alelos del mismo gen, y dirigir o bien un gen ligado a X-o bien a Y-en las células ES o tipo ES.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde (i) al menos el 95 % de las células de un ratón que de desarrolla a partir del blastocisto se derivan de las células donantes, o (ii) al menos el 99 % de las células de un ratón que se desarrolla a partir del blastocisto se derivan de las células donantes.

5. Un método para generar un embrión de ratón que comprende células que son heterocigóticas para una modificación genética, que comprende:

(a) introducir células donantes de ratón en un embrión huésped de ratón en pre-mórula, en donde las células donantes son células ES o tipo ES de un ratón endógamo; y son heterocigóticas para la modificación genética; y

(b) cultivar el embrión huésped en pre-mórula de (a) hasta el estadío de blastocisto, en donde al menos un 90 % de las células de un ratón que se desarrolla a partir del blastocisto se derivan de las células donantes.

6. El método de la reivindicación 5, que además comprende gestar el embrión de (b) en una madre ratón subrogada.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en donde (i) al menos un 95 % de las células de un ratón que se desarrolla a partir del blastocisto se derivan de las células donantes, o (ii) al menos el 99 % de las células de un ratón que se desarrolla a partir del blastocisto se derivan de las células donantes.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el embrión huésped en pre-mórula es: (i) un embrión diploide; y/o (ii) procedente de una cepa endógama o una cepa exógama.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el embrión huésped en pre-mórula es un embrión en estadío de 8 células.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el embrión huésped en pre-mórula comprende una zona pelúcida, y en donde las células donantes de ratón se introducen en el embrión huésped de ratón a través de una abertura en la zona pelúcida; de manera opcional en donde la abertura se crea mediante un láser.

11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las células donantes modificadas genéticamente se generan mediante:

(a) la obtención de un fragmento genómico elongado que contiene una secuencia de ADN de interés;

(b) el empleo de recombinación bacteriana homóloga para modificar genéticamente el fragmento genómico elongado de (a) para crear un vector de elongación (LTVEC) para su uso en las células donantes;

(c) introducir el LTVEC de (b) en las células donantes para modificar el gen endógeno o locus cromosómico en las células; y

(d) emplear un ensayo cuantitativo para detectar la modificación de alelos en las células donantes de (c) para identificar aquellas células donantes en donde el gen endógeno o locus cromosómico se han modificado genéticamente.

12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las células ES donantes proceden de una cepa de ratón endógamo seleccionada de entre el grupo que consiste en 129, C67BL/6 y BalbC.

13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el embrión huésped de ratón comprende un embrión endógamo de la cepa C57BL/6 o un embrión exógamo de la cepa Swiss Webster.

14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la etapa de cultivo (b) se condiciona por un factor de crecimiento, opcionalmente una proteína de la familia de Wnt; preferentemente Wnt3a.

15. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que además comprende la gestación del embrión de ratón modificado genéticamente para generar un ratón modificado genéticamente, en donde (i) cuando las células donantes son homocigóticas para la modificación genética, al menos el 90 % de las células del ratón modificado genéticamente son homocigóticas para la modificación genética; o (ii) cuando las células donantes son heterocigóticas para la modificación genética, al menos el 90 % de las células en el ratón modificado genéticamente son heterocigóticas para la modificación genética.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15 (i) en donde: (a) al menos el 95 % de las células en el ratón modificado genéticamente son homocigóticas para la modificación genética; o (b) al menos el 99 % de las células del ratón modificado genéticamente son homocigóticas para la modificación genética; o el método de acuerdo con la reivindicación 15 (ii) , en donde:

(a) al menos el 95 % de las células en el ratón modificado genéticamente son heterocigóticas para la modificación genética, o

(b) al menos el 99 % de las células en el ratón modificado genéticamente son heterocigóticas para la modificación genética.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 15 (i) , en donde al menos el 90 % de las células germinales en el ratón modificado genéticamente son homocigóticas para la modificación genética; o el método de acuerdo con la reivindicación 15 (ii) , en donde al menos el 90 % de las células germinales en el ratón modificado genéticamente son heterocigóticas para la modificación genética.

18. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde las células donantes son células femeninas XO y el ratón modificado genéticamente es un ratón XO.

19. Un embrión de ratón pre-mórula el cual comprende células donantes de ratón introducidas bajo la zona pelúcida, en donde las células donantes comprenden células ES o tipo ES procedentes de un ratón endógamo que son heterocigóticas u homocigóticas para una modificación genética.

20. El embrión de ratón en pre-mórula de la reivindicación 19, en donde el embrión en pre-mórula es un embrión en estadío de 8 células.

21. El embrión en pre-mórula de la reivindicación 19, en donde dichas células donantes ES proceden de una cepa de ratón endógama seleccionada de entre el grupo que consiste en 129, C57BL/6 y BalbC.