Materiales y métodos para la producción eficaz de succinato y malato.

Una cepa bacteriana modificada genéticamente que comprende modificaciones genéticas para los siguientes genes objetivo:

(a) acetato cinasa; (b) lactato deshidrogenasa; (c) alcohol deshidrogenasa; (d) transportador de formiato y (e) pirivato formiato liasa, anulando dichas modificaciones genéticas la actividad enzimática del polipéptido producido por dicho gen objetivo

Materiales y métodos para la producción eficaz de succlnato y malato Antecedentes de la invención

La producción fermentativa de succinato a partir de materias primas renovables será cada vez más competitiva conforme aumenten los precios del petróleo. El succinato puede servir como un sustrato para su transformación en plásticos, disolventes y otros productos químicos actualmente hechos del petróleo (Lee et al., 2004; Lee et al., 2005; McKinlay et al., 2007; Wendisch et al., 2006; Zeikus et al., 1999). Se han descrito muchas bacterias con la capacidad natural de producir succinato como un producto de fermentación principal (patente de EE. UU. Núm. 5.723.322; Tabla 1). Sin embargo, frecuentemente se requieren procesos complejos, medios complejos y tiempos de incubación largos.

Anteriormente se ha utilizado una variedad de enfoques genéticos para modificar genéticamente cepas de Escherichia coli para la producción de succinato con grados variables de éxito (Tabla 1). En la mayoría de los estudios, los títulos alcanzados fueron bajos, y fueron necesarios ingredientes de medio complejos tales como extracto de levadura o licor de maceración de maíz. La cepa NZN111 produjo succinato 108 mM con un rendimiento molar de 0,98 moles de succinato por mol de glucosa metabolizada (Chatterjee et al., 2001; Millard et al., 1996; Stols y Donnelly, 1997). Esta cepa fue manipulada genéticamente desactivando dos genes (pflB, que codifica piruvato formiato Nasa, y IdhA que codifica lactato deshidrogenasa), y expresando en exceso dos genes de E. coli, malato deshidrogenasa (mdh) y fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc), de plásmidos multicopia. La cepa HL27659k fue manipulada genéticamente mutando los genes de succinato deshidrogenasa (sdhAB), fosfato acetiltransferasa (pfa), acetato cinasa (ackA), piruvato oxidasa (poxB), transportador de glucosa (ptsG), y el represor de isocitrato Nasa (icIR). Esta cepa produjo succinato menor de 100 mM y requirió condiciones de fermentación de oxígeno limitado (Cox et al., 2006; Lin et al., 2005a, 2005b, 2005c; Yun et al., 2005). El análisis del metabolismo in silico se ha usado para diseñar genes desactivados para crear una ruta en E. coli análoga a la ruta de succinato nativa en Mannheimia succiniciproducens (Lee et al., 2005 y 2006). Sin embargo, la cepa resultante produjo muy poco succinato. Andersson et al. (2007) informaron sobre los valores más altos de producción de succinato (339 mM) por una E. coli manipulada genéticamente que contenía solo genes nativos.

Otros investigadores han buscado enfoques alternativos para expresar genes heterólogos en E. coli. La piruvato carboxilasa (pyc) de Rhizobium eteloti fue expresada en exceso a partir de un plásmido multicopia para dirigir el flujo de carbono a succinato (Gokarn et al., 2000; Vemuri et al., 2002a, 2002b). La cepa SBS550MG se construyó desactivando el represor de isocitrato Nasa (icIR), adhE, IdhA, y ackA, y expresando en exceso citZ (citrato sintasa) de Bacillus subtilis y pyc de R. etli de un plásmido multicopia (Sánchez et al., 2005a). Con esta cepa se produjo succinato 160 mM a partir de glucosa, con un rendimiento molar de 1,6.

También se han investigado procesos más complejos para la producción de succinato (Tabla 1). Muchos de estos procesos incluyen una fase de crecimiento aeróbico seguida por una fase de producción anaeróbica. En la fase anaeróbica se suministra frecuentemente dióxido de carbono, hidrógeno, o ambos (Andersson et al., 2007; Sánchez et al., 2005a y 2005b; Sánchez et al., 2006; patente de los Estados Unidos Núm. 5.869.301; Vemuri et al., 2002a y 2002b). En un estudio reciente con un productor de succinato nativo, A. succiniciproducens, se combinaron electrodiálisis, rociado con C02, reciclado celular, y alimentación por lotes (Meynial-Salles et al., 2007).

La presente invención proporciona varias formas de microorganismos, tales como cepas de £. coli, que producen succinato con títulos y rendimientos altos, en medios de sales minerales, durante fermentaciones simples por lote de pH controlado, sin la necesidad de genes heterólogos ni plásmidos. Durante el desarrollo, se caracterizó una cepa intermedia que produjo malato como producto dominante.

Breve resumen de la invención

El alcance de la presente invención está definido por las reivindicaciones y cualquier información que no se encuentre en las reivindicaciones es proporcionada solamente como información.

La presente invención se refiere a microorganismos novedosos útiles en la producción de ácido láctico, por ejemplo Escherichia coli. Por consiguiente, los materiales y métodos de la presente invención se pueden usar para producir succinato y malato para usarse en una variedad de aplicaciones.

En algunos aspectos de la descripción, se pueden usar derivados de Escherichia coli (también referida aquí como £. coli) para la construcción de cepas que producen succinato, malato y alanina. En varios aspectos se puede usar £. coli C (por ejemplo, ATCC 8739), como se puede usar cualquier otra cepa de E. coli que se pueda obtener de diversos depósitos o fuentes comerciales. También, en algunos aspectos, los microbios de la descripción modificados genéticamente contienen solo genes nativos (esto es, no contienen material genético de otros organismos). De la siguiente descripción se harán muy evidentes ventajas adicionales de esta exposición.

Breve descripción de las figuras

Figuras 1A-1B. Fermentación de glucosa a succinato. La Figura 1A muestra la ruta estándar de fermentación de glucosa en E. coli. Esta ruta ha sido modificada de Unden y Kleefeld (2004). Las flechas en negrita representan las rutas fermentativas centrales. Las cruces representan las supresiones de genes realizadas en este estudio para construir KJ012 (IdhA, adhE, ackA). Genes y enzimas: IdhA, lactato deshidrogenasa; pflB, piruvato-formiato Nasa; focA, transportador de formiato; pta, fosfato acetil transferasa; ackA, acetato cinasa; adhE, alcohol deshidrogenasa; ppc, fosfoenolpiruvato carboxilasa; pdh, complejo de piruvato deshidrogenasa; gltA, citrato sintasa; mdh, malato deshidrogenasa; fumA, fumB, y fumC, isoenzimas fumarasas; frdABCD, fumarato reductasa; fdh, formiato deshidrogenasa; icd, isocitrato deshidrogenasa; acs, acetil~CoA sintetasa; mgsA, metilglioxal sintasa; poxB, piruvato oxidasa; aldA, aldehido deshidrogenasa; y aldB, aldehido deshidrogenasa. La Figura 1B muestra el acoplamiento de la producción de ATP y el crecimiento con la producción de succinato y malato en cepas de E. coli modificadas genéticamente. Las flechas continuas conectan las reservas de NADH. Las flechas de puntos conectan las reservas de NAD+. Durante la glicólisis bajo condiciones anaeróbicas, el crecimiento está acoplado obligadamente con la producción de ATP y la oxidación de NADH.

Figuras 2A-2D. Rutas potenciales de carboxilación para la producción de succinato en E. coli. Los genes que codifican las enzimas clave de carboxilación se muestran en letra negrita. La Figura 2A muestra la PEP carboxilasa. No se produce ATP de fosfoenolpiruvato (PEP). Esta es considerada como la ruta principal para la producción de succinato en E. coli durante la fermentación de glucosa.

La Figura 2B muestra la enzima málica (NADH). La energía se conserva durante la producción de ATP a partir de ADP y PEP por medio de piruvato cinasa (pykA o pykF). La enzima málica (sfcA) cataliza una carboxilación reductiva conectada con NADH para producir malato. La Figura 2C muestra la enzima málica (NADPH). La energía se conserva durante la producción de ATP a partir de ADP y PEP por medio de piruvato cinasa (pykA o pykF). La enzima málica (maeB) cataliza una carboxilación reductiva conectada con NADPH para producir malato. La Figura 2D muestra la PEP carboxi cinasa. La energía se conserva por la producción de ATP durante la carboxilación de PEP para producir ácido oxaloacético.

Figuras 3A-3C. Crecimiento durante la evolución metabólica de KJ012 para producir KJ017, KJ032, y KJ060. La cepa KJ012 se transfirió secuencialmente en medio NBS que contenía 5% de glucosa (p/v) (Figura 3A) y 10% de glucosa (p/v) (Figura 3B), respectivamente, para producir KJ017. Después de la supresión de focA y pflB, la cepa resultante (KJ032) se sub-cultivó inicialmente en medio con un suplemento de acetato (Figura 3C). Los niveles de acetato disminuyeron y subsiguientemente se eliminaron durante transferencias adicionales para producir KJ060. La línea quebrada representa la fermentación por KJ017 sin añadir acetato, como comparación. Símbolos: densidad óptica a DO550nm,

Figuras 4A-4F. Resumen de productos de fermentación durante la evolución metabólica de cepas para la producción de succinato y malato. A los cultivos se les añadió un suplemento... [Seguir leyendo]

1. Una cepa bacteriana modificada genéticamente que comprende modificaciones genéticas para los siguientes genes objetivo: (a) acetato cinasa; (b) lactato deshidrogenasa; (c) alcohol deshidrogenasa; (d) transportador de formiato y (e) pirivato formiato liasa, anulando dichas modificaciones genéticas la actividad enzimática del polipéptido

producido por dicho gen objetivo.

2. La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente es Escherichia coli, Gluconobacter oxydans, Gluconobacter asan, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumescens, Arthrobacter paraffíneus,

Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter oxydans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus,

Brevibacterium ammoniagenes, divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fuscum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevibacterium testaceum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium immariophilium, Brevibacterium linens, Brevibacterium protopharmiae, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium 15 callunae, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia chrysanthemi, Flavobacterium peregrinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningosepticum, Micrococcus sp. CCM825, Morganella morganii, Nocardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, 20 Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri,

Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp. ATCC 15592, Rhodococcus sp. ATCC 19070, Sporosarcina ureae, Staphylococcus aureus, Vibrio metschnikovii, Vibrio tyrogenes, Actinomadura madurae, Actinomyces violaceochromogenes, Kitasatosporia parulosa, Streptomyces coelicolor, Streptomyces flavelus, 25 Streptomyces griseolus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivaceus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces virginiae, Streptomyces antibioticus, Streptomyces cacaoi, Streptomyces lavendulae, Streptomyces viridochromogenes, Aeromonas salmonicida, Bacillus pumilus, Bacillus circulans, Bacillus thiaminolyticus, Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serraba marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri, o Xanthomonas citri.

3. La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde dicha cepa

bacteriana modificada es Escherichia coli, preferiblemente E. coli B.

4. La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 3, en donde los genes objetivo están desactivados.

5. La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en 35 donde los siguientes genes objetivo están desactivados: a) acetato cinasa, b) lactato deshidrogenasa, c) alcohol

deshidrogenasa, d) pirivato formiato liasa, y e) piruvato oxidasa.

6. La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha cepa bacteriana comprende adicionalmente un gen de metilglioxal sintasa desactivado.

7. La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en 40 donde ésta comprende modificaciones genéticas para un gen de citrato liasa, un gen de lactato deshidrogenasa, un

gen de alcohol deshidrogenasa, un gen de acetato cinasa, un gen de transportador de formiato, un gen de piruvato formiato liasa, un gen de metilglioxal sintasa, un gen de piruvato oxidasa, y uno o más de los siguientes genes objetivo: a) aspartato amino transferasa, b) fosfato acetil transferasa, c) enzima mélica, y/o d) propionato cinasa/a- cetobutirato formiato liasa; desactivando dicha modificación genética la actividad enzimática del polipéptido 45 producido por dicho gen objetivo.

8. La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente está evolucionada metabólicamente.

9. La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde los genes, o porciones de los mismos están suprimidos o está desactivados con mutaciones de

desplazamiento de marco, mutaciones puntuales, inserción de codones de detención, o combinaciones de los mismos.

10. La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-9, en donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente es una cepa de E. coli y no contiene un gen exógeno o fragmento del mismo.

11. Una cepa bacteriana modificada genéticamente, en donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente es

KJ032 (depositada en la Colección de Cultivos para Investigación Agrícola con NRRL B-50024), KJ060 (depositada en la Colección de Cultivos para Investigación Agrícola con NRRL B-50025), KJ070 (depositada en la Colección de

Cultivos para Investigación Agrícola con NRRL B-50026), KJ071 (depositada en la Colección de Cultivos para Investigación Agrícola con NRRL B-50027), KJ072 (depositada en la Colección de Cultivos para Investigación Agrícola con NRRL B-50028), KJ073 (depositada en la Colección de Cultivos para Investigación Agrícola con NRRL B-50029), KJ091 (depositada en la Colección de Cultivos para Investigación Agrícola con NRRL B-50110), KJ098 5 (depositada en la Colección de Cultivos para Investigación Agrícola con NRRL B-50111), KJ104 (depositada en la Colección de Cultivos para Investigación Agrícola con NRRL B-50112), KJ110 (depositada en la Colección de Cultivos para Investigación Agrícola con NRRL B-50113), KJ119 (depositada en la Colección de Cultivos para Investigación Agrícola con NRRL B-50114) o KJ122 (depositada en la Colección de Cultivos para Investigación Agrícola con NRRL B-50115).

12. Un método de cultivo o desarrollo de una cepa bacteriana modificada genéticamente que comprende inocular un

medio de cultivo con una o más cepas bacterianas modificadas genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, y cultivar o desarrollar dicha cepa bacteriana modificada genéticamente.

13. Un método para producir succinato que comprende cultivar una o más cepas bacterianas modificadas genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en condiciones que permiten la

producción de succinato.

14. Una composición que comprende una o más cepas bacterianas modificadas genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y un medio.