Endo-beta-1,4-glucanasa.

Enzima que muestra actividad de endo-beta-1,4-glucanasa (EC 3.

2.1.4), que se selecciona de uno de:

(a) un polipéptido codificado por la secuencia de ADN de las posiciones 1 a 2.322 de SEC ID nº: 1;

(b) un polipéptido producido por la expresión de la secuencia de SEC ID nº: 1 por una célula huésped cultivada bajo condiciones que permiten la producción de la enzima;

(c) una enzima de endo-beta-1,4-glucanasa que tiene una secuencia de al menos 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la posición 1 a la posición 773 de SEC ID nº: 2, cuando la identidad se determina por GAP proporcionado en el paquete del programa GCG que utiliza una penalización de creación de GAP de 3,0 y penalización de extensión de GAP de 0,1.

Endo-beta-1, 4-glucanasa [0001] La presente invención se refiere a una enzima que muestra actividad de endo-beta-1, 4-glucanasa, esta enzima es endógena de la cepa de la especie Bacillus, DSM 12648, para una molécula de polinucleótido aislado que codifica tal endo-beta-1, 4-glucanasa, y al uso de la enzima en la industria del detergente, del papel y la pulpa, de las perforaciones petrolíferas, de la extracción petrolífera, del vino y del zumo, de los ingredientes alimenticios, del pienso para animales o textil.

Antecedentes de la invención [0002] La celulosa es un polímero de glucosa enlazado por enlaces beta-1, 4-glucosídicos. Las cadenas de celulosa forman numerosos enlaces de hidrógeno intra e intermoleculares, que suponen la formación de micro fibrillas de celulosa insolubles. La hidrólisis microbiana de celulosa a glucosa implica las siguientes tres clases principales de celulasas: (i) endoglucanasas (EC 3.2.1.4) que disocian enlaces beta-1, 4-glucosídicos aleatoriamente a lo largo de moléculas de celulosa, también denominadas endo-beta-1, 4-glucanasas, (ii) celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) que asimilan celulosa a partir del extremo no reducido, liberando celobiosa y (iii) beta-glucosidasas (EC 3.2.1.21) que hidrolizan celobiosa y celodextrinas de bajo peso molecular para liberar glucosa.

Los enlaces beta-1, 4-glucosídicos están también presentes en otros polímeros de origen natural, por ejemplo en los beta-glucanos de plantas tales como la cebada y la avena. En algunos casos, las endoglucanasas también proporcionan hidrólisis de tales polímeros no celulósicos.

Las celulasas son producidas por muchos microorganismos y frecuentemente están presentes en formas múltiples. El reconocimiento de la importancia económica de la degradación enzimática de celulosa ha favorecido una amplia búsqueda de celulasas microbianas, que se puedan usar industrialmente. Como resultado, las propiedades enzimáticas y las estructuras primarias de un gran número de celulasas se han investigado. Basándose en los resultados de un análisis de agrupamiento hidrofóbico de la secuencia de aminoácidos del dominio catalítico, estas celulasas se han colocado en familias diferentes de glicosil hidrolasas. Las glicosil hidrolasas bacterianas y fúngicas se han reagrupado en 35 familias (Henrissat, B.: A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 280 (1991) , 309-316 . Henrissat, B., and Bairoch, A.: New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 293 (1993) , 781-788.) . La mayoría de las celulasas consisten en un dominio de unión a la celulosa (CBD) y un dominio catalítico (CAD) separado por un enlazador que puede ser rico en prolina y residuos de hidroxiaminoácidos. Otra clasificación de celulasas se ha establecido basándose en la similitud de sus CBDs (Gilkes et al. (1991) ) dando cinco familias de glicosil hidrolasas (I-V) .

Las celulasas son sintetizadas por un gran número de microorganismos que incluyen hongos, actinomicetos, mixobacterias y bacterias reales, pero también por plantas. Especialmente endo-beta-1, 4-glucanasas de una amplia variedad de especificidades se han identificado. Muchas endoglucanasas bacterianas se han descrito (Gilbert, H.J. and Hazlewood, G.P. (1993) J. Gen. Microbiol. 139:187-194 . Henrissat, B., and Bairoch, A.: New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 293 (1993) , 781-788.) .

Un uso industrial importante de enzimas celulolíticas es para el tratamiento de la pasta de papel, por ejemplo para mejorar el drenaje o para destintar el papel reciclado. Otro uso industrial importante de las enzimas celulolíticas es para el tratamiento de tejidos o textiles celulósicos, por ejemplo, como ingredientes en composiciones detergentes o composiciones de suavizantes textiles, para el biopulido de telas nuevas (acabado de las prendas) y para obtener un aspecto de "lavado a la piedra" del tejido que contiene celulosa, especialmente tela vaquera, y diferentes métodos para este tipo de tratamiento se han sugerido, por ejemplo en las GB-A-1 368 599, EP-A-0 307 564 y EP-A-0 435 876, WO 91/17243, WO 91/10732, WO 91/17244, WO 95/24471 y WO 95/26398. La solicitud de patente japonesa nº 13049/1999 divulga una celulasa alcalina resistente al calor derivada de la especie Bacillus KSM-S237 (depositada como FERM-P16067) adecuada para detergentes.

Existe una constante necesidad de proporcionar enzimas de celulasa nuevas o preparaciones enzimáticas que se puedan usar para aplicaciones donde la actividad de celulasa, preferiblemente una endo-beta-1, 4-glucanasa, (EC 3, 2, 1, 4) sea deseable.

El objetivo de la presente invención es proporcionar enzimas nuevas y composiciones enzimáticas que tengan actividad sustancial de beta-1, 4-glucanasa bajo condiciones de ligeramente ácidas a alcalinas y rendimiento mejorado en el tratamiento de la pasta de papel, tratamiento textil, procesos de lavandería, procesos de extracción o el pienso para animales; preferiblemente tales nuevas endoglucanasas que tienen buenos rendimientos se pueden producir o se producen usando técnicas recombinantes en altos rendimientos.

Resumen de la invención

Los inventores han encontrado una enzima nueva que tiene actividad sustancial de endo-beta-1, 4-glucanasa (clasificada según la nomenclatura enzimática como EC 3.2.1.4) , esta enzima es endógena de una cepa de la especie Bacillus AA349 (DSM 12648) , y los inventores han conseguido con éxito la clonación y la expresión de una secuencia de ADN que codifica tal enzima. La endo-beta-1, 4-glucanasa de la invención tiene propiedades de estabilidad y actividad que la hacen excepcionalmente adecuada para usarla en aplicaciones que implican soluciones alcalinas acuosas que contienen surfactantes y/o blanqueantes. Tales condiciones de aplicación se encuentra de forma muy común, tanto en detergentes domésticos como industriales, tratamientos de acabado textil y en la producción o reciclaje de pulpas celulósicas.

Debido a que la beta-1, 4-glucanasa de la invención mantiene su actividad hasta un grado excepcional bajo tales condiciones de aplicación pertinentes, se contempla que será más útil que otras enzimas conocidas, por ejemplo, cuando se usa en detergentes, para el procesamiento de papel/pulpa o para tratamientos textiles.

También cabe destacar que la beta-1, 4-glucanasa de la invención no es significativamente inactivada por iones de Fe (II) . Una sensibilidad de la actividad enzimática a la presencia de iones ferrosos podrían plantear restricciones en la aplicabilidad de la enzima, tal como en procesos que tengan lugar en contenedores metálicos.

Por consiguiente, en su primer aspecto, la presente invención se refiere a una enzima que muestra actividad de endo-beta-1, 4-glucanasa (EC 3.2.1.4) , que se selecciona de uno de (a) un polipéptido codificado por la secuencia de ADN de las posiciones 1 a 2.322 de SEC ID nº 1, (b) un polipéptido producido por expresión de la secuencia de SEC ID nº : 1 por una célula huésped cultivada bajo condiciones que permitan la producción de la enzima o (c) una enzima de endo-beta-1, 4-glucanasa que tiene una secuencia de al menos 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la posición 1 a la posición 773 de SEC ID nº : 2, cuando la identidad se determina por GAP provisto en el paquete de programa GCG que utiliza una penalización de creación de GAP de 3, 0 y una penalización de extensión de GAP de 0, 1.

(a) En su segundo aspecto, la invención se refiere a una molécula de polinucleótido aislado, preferiblemente una molécula de ADN, que codifica el dominio catalíticamente activo de una enzima que muestra actividad de endo-beta-1, 4glucanasa cuya molécula se selecciona del grupo que consiste en (a) moléculas de polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos como se muestra en SEC ID nº : 1 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 2.322, (b) moléculas de polinucleótidos que codifican un polipéptido que es al menos 99% idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº : 2 del residuo de aminoácido 1 hasta el residuo de aminoácido 773 cuando la identidad se determina por GAP proporcionado en el paquete de programa GCG utilizando una penalización de creación de GAP de 3, 0 y una penalización de extensión de GAP de 0, 1, (c) moléculas complementarias de (a) o (b) y (d) secuencias de nucleótidos degeneradas de (a) o (b) .

En su tercer, cuarto y quinto aspecto la invención proporciona un vector de expresión que comprende un segmento de ADN que es, por ejemplo, una molécula de polinucleótido de la invención, una célula que comprende el segmento... [Seguir leyendo]

1. Enzima que muestra actividad de endo-beta-1, 4-glucanasa (EC 3.2.1.4) , que se selecciona de uno de:

(a) un polipéptido codificado por la secuencia de ADN de las posiciones 1 a 2.322 de SEC ID nº : 1;

(b) un polipéptido producido por la expresión de la secuencia de SEC ID nº : 1 por una célula huésped cultivada bajo condiciones que permiten la producción de la enzima;

(c) una enzima de endo-beta-1, 4-glucanasa que tiene una secuencia de al menos 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la posición 1 a la posición 773 de SEC ID nº : 2, cuando la identidad se determina por GAP proporcionado en el paquete del programa GCG que utiliza una penalización de creación de GAP de 3, 0 y penalización de extensión de GAP de 0, 1.

2. Enzima según la reivindicación 1, esta enzima es un polipéptido endógeno de la especie Bacillus sp., DSM 12648.

3. Molécula de polinucleótido aislada que codifica un polipéptido que tiene actividad de endo-beta-1, 4-endo-glucanasa seleccionada del grupo que consiste en:

(a) moléculas de polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos como se muestra en SEC ID nº : 1 del nucleótido 1 al nucleótido 2.322;

(b) moléculas de polinucleótidos que codifican un polipéptido que es al menos 99% idéntico a la secuencia de aminoácidos de la posición 1 a la posición 773 de SEC ID nº : 2, cuando la identidad se determina por GAP proporcionado en el paquete de programa GCG que utiliza una penalización de creación de GAP de 3, 0 y una penalización de extensión de GAP de 0, 1.

(c) moléculas complementarias de (a) o (b) ; y

(d) secuencias de nucleótidos degeneradas de (a) o (b) .

4. Molécula de polinucleótido aislado según la reivindicación 3, donde el polinucleótido es ADN.

5. Constructo de polinucleótido que comprende la molécula de polinucleótido según las reivindicaciones 3 o 4.

6. Vector de expresión que comprende los siguientes elementos operativamente enlazados: un promotor de transcripción, un segmento de ADN seleccionado del grupo que consiste en:

(a) moléculas de polinucleótidos que codifican un polipéptido que tiene actividad de endo-beta-1, 4-glucanasa que comprende una secuencia de nucleótidos como se muestra en SEC ID nº : 1 del nucleótido 1 al nucleótido 2.322,

(b) moléculas de polinucleótidos que codifican un polipéptido que tiene actividad de endo-beta-1, 4-glucanasa que es al menos 99% idéntico a la secuencia de aminoácidos de la posición 1 a la posición 773 de SEC ID nº : 2, cuando la identidad se determina por GAP proporcionado en el paquete del programa GCG que utiliza una penalización de creación de GAP de 3, 0 y penalización de extensión de GAP de 0, 1, y

(c) secuencias de nucleótidos degeneradas de (a) o (b) ; y un terminador de transcripción.

7. Célula cultivada en la que se ha introducido un vector de expresión según la reivindicación 6, donde dicha célula expresa el polipéptido codificado por el segmento de ADN.

8. Célula según la reivindicación 7, que es una célula procariótica, en particular una célula bacteriana.

9. Célula según la reivindicación 8, donde la célula pertenece a una cepa de Bacillus, preferiblemente una cepa de Bacillus subtilis o Bacillus lentus.

10. Célula según la reivindicación 8, donde la célula pertenece a una cepa de Bacillus licheniformis, preferiblemente Bacillus licheniformis, ATCC 14580.

11. Célula según la reivindicación 8, donde la célula pertenece a una cepa de Pseudomonas, preferiblemente una cepa de Pseudomonas fluorescens o Pseudomonas mendocina.

12. Célula según la reivindicación 8, donde la célula pertenece a una cepa de Streptomyces.

13. Célula según la reivindicación 7 donde la célula pertenece a una cepa de Saccharomyces, preferiblemente una cepa de Saccharomyces cerevisiae.

14. Método para producir un polipéptido con actividad de endo-beta-1, 4-glucanasa que comprende el cultivo de una célula en la que se ha introducido un vector de expresión según la reivindicación 6, de tal manera que dicha célula expresa un polipéptido codificado por el segmento de ADN y la recuperación del polipéptido.

15. Composición enzimática que comprende la enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

16. Composición según la reivindicación 15 que comprende además una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en proteasas, celulasas (endoglucanasas) , beta-glucanasas, hemicelulasas, lipasas, peroxidasas, lacasas, alfaamilasas, glucoamilasas, cutinasas, pectinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, ligninasas, pululanasas, pectato liasas, xiloglucanasas, xilanasas, pectina acetil esterasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, pectina liasas,

otras mananasas, pectina metil-esterasas, celobiohidrolasas, transglutaminasas o sus mezclas derivadas.

17. Composición enzimática según la reivindicación 15, que incluye una enzima aislada que tiene actividad de endobeta-1, 4-glucanasa, donde la enzima (i) está libre de impurezas homólogas y (ii) es producida por el método según la reivindicación 14.

18. Método para la degradación de biomasa que contiene celulosa, donde la biomasa se trata con una cantidad eficaz de la enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o de la composición enzimática según cualquiera de las reivindicaciones 15-17.

19. Composición de detergente que comprende una endo-beta-1, 4-glucanasa según cualquiera de las reivindicaciones 1

o 2.

20. Uso de una endo-beta-1, 4-glucanasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 en una composición de detergente. 20

21. Uso de una endo-beta-1, 4-glucanasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 en procesos de acabado textil.