Desacilación de LPS en bacterias Gram negativas.

Bacteria de Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis o Bordetella bronchiseptica o bacteria de la especies de Neisseria que comprende un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos codificando un polipéptido con al menos 95% identidad de secuencia de aminoácidos con SEC I D nº:

1, donde la secuencia de ácidos nucleicos confiere un aumento en la actividad de la 3-O-deacilasa del lípido A en comparación con la bacteria de tipo salvaje.

Desacilación de LPS en bacterias Gram negativas Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere al área de la microbiología, en particular la biología de síntesis y modificación de los LPS (lipopolisacáridos) de bacterias Gram negativas. La invención también se refiere al campo de la medicina, en particular al campo de la vacunación contra patógenos bacterianos. La presente invención además se refiere a bacterias Gram negativas, lipopolisacáridos bacterianos de Gram negativas (LPS) y composiciones que constan de LPS, que pueden usarse con fines farmacéuticos y/o veterinarios, en particular para la preparación de vacunas contra Gram negativas tal como Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis y Bordetella bronchiseptica. La invención además dispone vacunas que constan de LPS desacetilados, y el uso de LPS modificados y detoxificados en la preparación de vacunas de células enteras y vacunas acelulares.

Antecedentes de la invención [0002] La infección por Bordetella pertussis es un agente causante de tos ferina, con un número estimado de 60 millones de casos cada año, causando la muerte de aproximadamente 355.000 personas a nivel mundial cada año (OMS) , en particular niños e individuos con sistemas inmunitarios comprometidos. Aunque se encuentra disponible el tratamiento con antibióticos (eritromicina) , para cuando la enfermedad es diagnosticada, frecuentemente las toxinas bacterianas han causado daños severos. La prevención de la enfermedad es, por lo tanto, de gran importancia. Uno de los principales medios de control es la vacunación. De forma convencional, las vacunas contra las infecciones de pertussis ("tos ferina") se han basado en células enteras de B. pertussis. Las vacunas de células enteras de Bordetella pertussis, que comprenden bacterias enteras matadas por tratamiento térmico, formalina u otros medios, han sido incluidas en programas generales de vacunación desde principios de los años 50.

La inmunización con la vacuna de células enteras de pertussis, a la vez que resulta eficaz en la prevención de la tos ferina en bebés, se ha asociado con reacciones neurológicas, locales y sistémicas, incluyendo fiebre, convulsiones y encefalopatía en niños. Los LPS son responsables de la mayor parte de las reacciones adversas en niños tras la inmunización de pertussis. Cuando se producen infecciones bacterianas en animales, los LPS o su fracción de lípido A activan el sistema inmunológico innato mediante la interacción con receptores de tipo Toll, principalmente mediante TLR

4. La respuesta del infectado para lípidos A menudo incluye la producción de péptidos antimicrobianos catiónicos, citocinas, quimiocinas y moléculas inmunoestimuladoras adicionales. En algunas infecciones, la respuesta del lípido A ayuda a alejar a la bacteria, pero en sepsis incontrolables, los altos niveles de citocinas circulantes y la actividad que favorece la coagulación pueden dañar la microvasculatura y precipitar el síndrome de shock séptico por Gram negativas con coagulación intravascular diseminada.

No hay pruebas concluyentes disponibles acerca del papel de protección que los LPS juegan en las vacunas de pertussis, sin embargo los experimentos de inmunización pasiva en ratones han demostrado que los anticuerpos contra LPS pueden conferir un nivel de protección. Además y de forma más importante, la presencia de LPS en una vacuna no obstante proporciona actividad adyuvante para aumentar la respuesta inmune contra otros antígenos (K. Mills: Immunity to Bordetella pertussis. Microbes and Infection 3: 655-677 (2001) .

El interés sobre la seguridad ha afectado inversamente al entendimiento de la vacuna y ha motivado el desarrollo de vacunas de pertussis acelulares, preparadas con antígenos altamente purificados de B. pertussis. En los últimos años, además de las denominadas "vacunas de células enteras" o "VCEs", también las vacunas acelulares o "VACs" han sido ahora introducidas en diferentes países.

Las vacunas acelulares normalmente comprenden de 1 a 3 o más antígenos del organismo patógeno. En el caso de los antígenos de B. pertussis comúnmente se utilizan los siguientes: toxina de pertussis (PT, normalmente tratada para la destrucción de su toxicidad al mismo tiempo que logra retener la inmunogenicidad) , hemaglutinina filamentosa (FHA) , fimbrias, y la proteína 69kD o pertactina (Pm) . En general, la reactogenicidad de las vacunas acelulares es muy inferior a la reactogenicidad de las vacuna de célula enteras. Las vacunas acelulares se asocian con una frecuencia significativamente reducida de reacciones sistémicas (fiebre, vómitos, irritabilidad, anorexia) y reacciones locales (inflamación, rojez, calor, sensibilidad, rigidez, dolor) . No obstante, los datos clínicos son todavía controvertidos en cuanto a si la inmunidad protectora de las vacunas acelulares se combina con el efecto protector de las vacunas de células enteras. En muchos estudios el efecto protector de las vacunas de células enteras resulta ser superior y en la actualidad se mantiene un debate sobre si esto pesa más que los riesgos de los raros pero graves efectos adversos de las vacunas de células enteras en bebés. Actualmente se han evaluado varios esquemas de inmunización, donde se dan hasta seis dosis de vacuna acelular. La vacuna de células enteras fue dada inicialmente 5 veces, incorporada al calendario rutinario de vacunas rutinario con la última dosis adicional dándose entre los 4 y 6 años de edad. Se recomienda ahora que la vacuna acelular de pertussis se de 6 veces incluyendo una última dosis (combinada con la vacuna del tétanos-difteria) durante la pubertad. La vacuna acelular parece ser más segura que la vacuna de células enteras, pero ambas no deberían darse en niños con reacciones alérgicas previas a la vacuna de pertussis.

Los efectos secundarios adversos de las vacunas de células enteras de pertussis han sido bien documentados en la técnica (ver: S.H. Yeh: persistent pathogen, imperfect vaccines. Expert Rev. Vaccines 2: 113-127 (2003 ) . Aunque las vacunas acelulares son usadas actualmente en parte para superar estos efectos secundarios adversos, la inmunidad protectora proporcionada por las mismas sigue resultando controvertida y deja mucho espacio para su mejora. En un modelo con ratones se encontró de forma significativa una protección superior a largo plazo con células enteras en comparación con las vacunas acelulares (K. Mills: Immunity to Bordetella pertussis. Microbes and Infection 3: 655-677 (2001 ) ) . Por otra parte, las vacunas acelulares son más costosas y más difíciles de producir, requiriendo aislamiento, una extensa purificación y control de calidad de varios antígenos y su mezcla y formulación en las cantidades óptimas / deseadas. Claramente existe una gran necesidad de mejora de las vacunas contra B. pertussis, B. parapertussis, B. bronchiseptica y otras bacterias Gram negativas.

Descripción detallada de la invención [0008] La presente invención proporciona métodos y medios para la preparación de vacunas mejoradas contra pertussis. La invención divulga nuevas proteínas de Bordetella. Estas nuevas proteínas de B. pertussis, B. parapertussis y B. bronchiseptica y moléculas de ADN que codifican estas proteínas se usan de acuerdo con la invención con el fin de modificar el lípido A y así proporcionar nuevas cepas bacterinas de B. pertussis, B. parapertussis y B. bronchiseptica y otras células bacterianas Gram negativas, constando de al menos LPS detoxificados y 3-O-desacetilados parcialmente. La presente invención también proporciona composiciones mejoradas para la vacunación, constando de células bacterianas de especies de Bordetella que comprenden LPS 3-O-desacetilados parcialmente, composiciones farmacéuticas que comprenden LPS aislados y al menos LPS parcialmente 3-O-desacetilados o LPS 3-O-desacetilados in vitro. La divulgación además proporciona anticuerpos específicos y dirigidos contra el lípido A 3-O-desacetilado y/o moléculas de LPS.

Los lipopolisacáridos (LPS) , componentes principales de la membrana bacteriana externa de Gram negativa, son conocidos por su importancia en el funcionamiento de dicha membrana como barrera de permeabilidad y por su resistencia contra la lisis complementada y mediada por células (visto en 1) . Consta de tres dominios covalentemente enlazados: el lípido A, el núcleo, y el antígeno O. El lípido A forma el anclaje de la membrana hidrofóbica y es el responsable de la actividad endotóxica de los LPS. En Escherichia coli, consta de un disacárido de glucosamina 1, 4'bifosforilado β-1, 6-vinculado, que se sustituye con residuos de ácidos R-3-hidroximirísticos en las posiciones 2, 3, 2', y 3' por medio de éster o enlace amídico. Los grupos secundarios de lauroilo... [Seguir leyendo]

1. Bacteria de Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis o Bordetella bronchiseptica o bacteria de la especies de Neisseria que comprende un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos codificando un polipéptido con al menos 95% identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID nº : 1, donde la secuencia de ácidos nucleicos confiere un aumento en la actividad de la 3-O-deacilasa del lípido A en comparación con la bacteria de tipo salvaje.

2. Bacteria de acuerdo con la reivindicación 1, donde la bacteria es Neisseria Meningitidis, Neisseria gonorrhoeae o Neisseria lactamica.

3. Bacteria de Bordetella pertussis que comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1 y que confiere actividad de 3-O-deacilasa de lípido A a la bacteria.

4. Método para la producción de LPS al menos parcialmente 3-O-desacetilados, donde el método comprende el proceso de cultivo de una bacteria tal y como se describe en las reivindicaciones de 1 a 3 bajo condiciones propicias para la síntesis de LPS al menos parcialmente 3-O-desacetilados y, opcionalmente, recuperación de LPS al menos parcialmente 3-O-desacetilados, donde los LPS al menos parcialmente 3-O-desacetilados comprenden al menos el 10 por ciento de su total de lípido A en la forma 3-O-desacetilada.

5. Composición que comprende LPS obtenibles a partir de una bacteria Bordetella pertussis o bacterias de Neisseria tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, donde al menos el 10 por ciento del total de lípido A en los LPS en la composición se encuentra en la forma 3-O-desacetilada.

6. Bacterias de Bordetella pertussis de acuerdo con las reivindicaciones de 1 a 3, para su uso en el tratamiento o prevención de infecciones de Bordetella pertussis.

7. Uso de bacterias de Bordetella pertussis de acuerdo con las reivindicaciones de 1 a 3 para la producción de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección de Bordetella pertussis.

8. Composición que consta de LPS obtenibles a partir de bacterias de Bordetella pertussis tal y como se describe en las reivindicaciones de 1 a 3, donde al menos el 10 por ciento de lípido A total en los LPS en la composición se encuentra en forma 3-O-desacetilada, para su uso en el tratamiento o prevención de infección de Bordetella pertussis.

9. Uso de una composición que comprende LPS obtenibles a partir de una bacteria de Bordetella pertussis tal y como se describe en las reivindicaciones de 1 a 3, donde al menos el 10 por ciento del total de lípido A en los LPS en la composición se encuentra en la forma 3-O-desacetilada, para la producción de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección de Bordetella pertussis.

10. Vacuna de células enteras que comprende una bacteria de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, donde la bacteria es Bordetella pertussis o del género Neisseria.

11. Vacuna acelular que comprende una composición de acuerdo con la reivindicación 5.

12. Método in vitro para la desacilación de LPS de bacterias de Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis o Bordetella bronchiseptica o especies de Neisseria o composiciones que comprenden LPS, comprendiendo el proceso de la puesta en contacto de LPS o la composición con un polipéptido que muestra al menos 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID nº : 1 y que muestra actividad de 3-O-deacilasa de lípido A, bajo condiciones propicias para la desacilación enzimática de LPS de bacterias Gram negativas.