Conjugados de Factor IX con semividas extendidas.

Un conjugado de Factor IX-polietilenglicol (FIX-PEG), en donde uno o más grupos de polietilenglicol se unen al Factor IX a través de un resto que contiene PEG que une en puente dos residuos de cisteína que forman un enlace disulfuro en el Factor IX nativo.

Conjugados de Factor IX con semividas extendidas 1. Campo de la invención La presente invención se refiere a conjugados poliméricos biocompatibles del Factor IX, composiciones que comprenden conjugados de Factor IX y usos de dichos conjugados para tratar la hemofilia. El Factor IX pegilado se describe por ejemplo, en el documento WO2007/135182.

2. Compendio de la invención El solicitante ha determinado que la fabricación de Factor IX recombinante (denominado en esta memoria como FIX) puede mejorarse conjugando FIX a uno o más grupos polietilenglicol como se define en las reivindicaciones de manera que FIX puede separarse de forma efectiva del Factor IXa (denominado en esta memoria como FIXa) . Las propiedades de fabricación mejoradas incluyen también la capacidad de producir conjugados de FIX de alta pureza.

Los conjugados de FIX proporcionarían beneficios terapéuticos, por ejemplo, cuando se compara con FIX no conjugado. Dichos beneficios terapéuticos incluyen, aunque no están limitados a, semivida de circulación aumentada, inmunogenicidad reducida, mayor actividad, menores necesidades de dosificación, y permitir rutas alternativas de administración (por ejemplo, de forma subcutánea) .

Como se usan en esta memoria, los términos “conjugado de Factor IX” o “conjugado de FIX” se refiere al Factor IX que se ha modificado para incluir un resto que contiene polietilenglicol (PEG) en polímero biocompatible que da por resultado un perfil farmacocinético mejorado en comparación al Factor IX no modificado. La mejora en el perfil farmacocinético puede observarse como una mejora en uno o más de los parámetros siguientes: potencia, estabilidad, área bajo la curva y semivida circulante.

En una realización específica, los conjugados de FIX de alta pureza descritos en esta memoria están esencialmente libres de FIXa. Considerado un contaminante de las composiciones de FIX, incluso cantidades traza de FIXa pueden dar por resultado trombosis peligrosa según Gray et al. Thromb. Haemost. Abril de 1995, 73 (4) :675-9) .

Como se usa en esta memoria, el término “esencialmente libre de FIXa”, en el contexto de purificación de FIX y conjugados de FIX, se refiere a cantidades de FIXa que están por debajo de 1 u de FIXa/1000 UI de FIX. Pequeñas concentraciones de FIXa pueden medirse según las técnicas descritas en Gray et al. Thromb. Haemost. Abril de 1995; 73 (4) :675-9. En algunas realizaciones, la cantidad de contaminante FIXa puede ser menor que 0, 5 u de FIXa/1000 UI de FIX. En algunas realizaciones, la cantidad de contaminante FIXa puede ser menor que 0, 25 u de FIXa/1000 UI de FIX. En algunas realizaciones, la cantidad de FIXa puede ser menor que 0, 1 u de FIXa/1000 UI de FIX.

La conjugación de FIX con un polietilenglicol mejora la capacidad de separación del conjugado de FIX del FIXa y mejora así la utilidad de FIX en composiciones farmacéuticas. Además, el polietilenglicol puede proteger a FIX de la degradación y respuesta de anticuerpos. Los conjugados de FIX pueden tener una prolongada semivida circulante, lo que da por resultado un efecto que permite reducir la dosis y administración menos frecuente. En la invención, el FIX se conjuga a uno o más restos de polietilenglicol (PEG) como se define en las reivindicaciones.

Así en un primer aspecto, la invención proporciona un conjugado de Factor IX-polietilenglicol (PEG) , en donde uno o más grupos de polietileno están unidos al Factor IX a través de un resto que contiene PEG que une en puente dos residuos de cisteína que forman un enlace disulfuro en el Factor IX nativo.

Por lo tanto, la unión que contiene PEG une en puente el enlace disulfuro. En una realización específica, un conjugado de FIX-PEG puede ser según la fórmula:

en donde R1 representa un grupo de unión que puede ser un enlace directo, un grupo alquileno (preferiblemente un grupo alquileno C1-10) o un grupo arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; en donde los grupos arilo incluyen grupos fenilo, benzoilo y naftilo;

en donde grupos heteroarilo adecuados incluyen piridina, pirrol, furano, pirano, imidazol, pirazol, oxazol, piridazina, pirimidina y purina;

en donde la unión al polímero puede ser por medio de un enlace hidrolíticamente lábil, o mediante un enlace no lábil.

Los sustituyentes que pueden estar presentes en un grupo arilo o heteroarilo opcionalmente sustituidos incluyen por ejemplo uno o más de los mismos o diferentes sustituyentes seleccionados de –CN, -NO2, -CO2R, -COH, -CH2OH, -COR, -OR, -OCOR, -OCO2R, -SR, -SOR, -SO2R, -NHCOR, -NRCOR, -NHCO2R, -NR’CO2R, -NO, -NHOH, -NR’OH, -C=N-NHCOR, -C=N-NR’COR, -N+R3, -N+H3, -N+HR2, halógeno, por ejemplo flúor o cloro, -C=CR, -C=CR2 y13C=CHR, en que cada R o R’ representa independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo (preferiblemente C1-6) o un arilo (preferiblemente fenilo) . La presencia de sustituyentes aceptores de electrones se prefiere especialmente.

En otra realización, PEG se conjuga con FIX según la fórmula:

El resto que contiene PEG puede tener un peso molecular de aproximadamente 10 kDa. El conjugado de FIX-PEG puede tener un resto que contiene PEG. De forma alternativa, el conjugado de FIX-PEG puede tener dos restos que contienen PEG.

Los conjugados de FIX pueden fabricarse de manera que estén esencialmente libres de FIXa. Bajo ciertas condiciones las velocidades a las que FIX y FIXa reaccionan con un sustrato polimérico biocompatible puede ser diferente. Sin estar atado por la teoría, la diferencia en velocidad de reacción puede deberse al diferente tamaño (FIX tiene un peso molecular que es 11 kDa mayor que FIXa) y/o diferentes estructuras conformacionales de FIX y FIXa. La estructura de FIX se muestra en la Figura 1, que incluye el dominio de activación que se escinde en la activación de FIX a FIXa. Como resultado, el residuo de cadena lateral que se va a conjugar puede ser más accesible estéricamente al reactivo que contiene polímero en FIX o FIXa, y cuanto más accesible sea el residuo reaccionará más rápido con el reactivo que contiene el polímero. Esta diferencia en reactividad permite en último lugar una separación cinética de FIX y FIXa.

El FIX producido de forma recombinante puede contener pequeñas cantidades de FIXa como un contaminante. A veces estas cantidades pueden ser extremadamente pequeñas, del orden de 1 u de FIXa/1000 UI de FIX (Gray et al. Thromb. Haemost. Abril de 1995; 73 (4) :675-9) . Bajo algunas condiciones la velocidad de formación de un conjugado de FIX, tal como FIX-PEG, puede ser más rápido que la velocidad de formación para FIXa-PEG. En esta situación, una cantidad estequiométrica o sub-estequiométrica del reactivo PEG respecto a FIX puede añadirse a la mezcla de reacción. En este ejemplo, todo el reactivo PEG se consume en la formación del conjugado FIX-PEG, mientras que FIXa permanece sin reaccionar. Las propiedades del conjugado de FIX-PEG, tal como peso molecular y polaridad, le permiten separarse fácilmente de FIXa usando técnicas de purificación conocidas en la técnica, que incluyen aunque no están limitadas a cromatografía de exclusión por tamaño y/o de intercambio iónico que pueden usarse en la etapa de purificación.

Bajo algunas condiciones la velocidad de formación de un conjugado de FIXa, tal como FIXa-PEG, es más rápida que la velocidad de formación para FIX-PEG. Bajo estas condiciones, puede añadirse exceso estequiométrico del reactivo PEG respecto a FIXa a la mezcla de reacción. En este ejemplo, es importante asegurarse de que todo el FIXa se consume en la formación de FIXa-PEG, mientras la mayoría de FIX, si no todo el FIX permanece sin reaccionar en su estado no conjugado. Las propiedades del conjugado de FIXa-PEG, tal como peso molecular y polaridad, le permiten separarse fácilmente del FIX no conjugado usando técnicas conocidas en la técnica. En una realización, el FIX no conjugado se purifica por cromatografía de exclusión por tamaño o de filtración en gel. El FIX puro resultante puede entonces conjugarse con PEG, que da por resultado un conjugado de FIX-PEG puro.

Los conjugados de FIX tienen una o más de las actividades biológicas de FIX no modificado (es decir, FIX sin PEG unido) . Un conjugado de FIX puede activarse in vivo por el Factor XIa o VIIa y factor tisular, para dar Factor IXa. La actividad biológica de los conjugados de FIX puede determinarse usando los ensayos descritos en esta memoria.

Comparado con FIX no modificado, los conjugados de FIX de la invención pueden mostrar una mejora en uno o más parámetros del perfil farmacocinético, que incluye área bajo la curva (ABC) , Cmax, aclaramiento (AC) , semivida, tiempo de residencia... [Seguir leyendo]

1. Un conjugado de Factor IX-polietilenglicol (FIX-PEG) , en donde uno o más grupos de polietilenglicol se unen al Factor IX a través de un resto que contiene PEG que une en puente dos residuos de cisteína que forman un enlace disulfuro en el Factor IX nativo.

2. El conjugado de FIX-PEG según la reivindicación 1, según la fórmula:

en donde R1 representa un grupo de unión que puede ser un enlace directo, un grupo alquileno (preferiblemente un grupo alquileno C1-10) o un grupo arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido;

en donde los grupos arilo incluyen grupos fenilo y naftilo; en donde grupos heteroarilo adecuados incluyen piridina, pirrol, furano, pirano, imidazol, pirazol, oxazol, piridazina, pirimidina y purina;

en donde la unión al polímero puede ser por medio de un enlace hidrolíticamente lábil o mediante un enlace no lábil.

3. El conjugado de FIX-PEG de la reivindicación 2, según la fórmula:

4. El conjugado de FIX-PEG según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el uno o más resto que contiene PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 10 kDa.

5. El conjugado de FIX-PEG según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que tiene un resto que contiene PEG.

6. El conjugado de FIX-PEG según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que tiene dos restos que contienen PEG.

7. Una composición que comprende el conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la composición también comprende un diluyente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. La composición según la reivindicación 7, en donde la composición se ha formulado para administración parenteral.

9. La composición según la reivindicación 8, que es adecuada para inyecciones intradérmicas, subcutáneas e intramusculares, e infusiones intravenosas o intraóseas.

10. Una composición que comprende el conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que toma la forma de disolución, suspensión o emulsión.

11. El conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el conjugado de FIX-PEG tiene una semivida más larga en comparación con FIX no modificado.

12. El conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el conjugado de FIX-PEG tiene un mayor ABC en comparación con FIX no modificado.

13. El conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el conjugado de FIX-PEG tiene una biodisponibilidad mayor en comparación con FIX no modificado.

14. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de FIX-PEG según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un diluyente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable para usar en el tratamiento de hemofilia B.

15. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de FIX-PEG según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un diluyente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde la composición está esencialmente libre de Factor IXa, para usar en la reducción del riesgo de hemartrosis, hemorragia, sangrado gastrointestinal y menorragia en mamíferos con hemofilia B.

16. La composición según la reivindicación 15, en donde la puntuación media de trombo de la composición es menor que 1 después de tres experimentos independientes.

17. La composición según la reivindicación 15, en donde la puntuación media de trombo de la composición es menor que 0, 5 después de tres experimentos independientes.

18. La composición según la reivindicación 15, en donde la puntuación media de trombo de la composición es 0 10 después de tres experimentos independientes.

19. La composición según la reivindicación 14, en donde la composición se administra de forma subcutánea.

20. La composición según la reivindicación 14, en donde la composición se administra de forma intravenosa.

21. La composición según la reivindicación 14, en donde la composición lleva a una incidencia reducida de

trombosis en comparación con composiciones de Factor IX recombinante que comprenden una cantidad medible de 15 Factor IXa.

22. La composición según la reivindicación 14, en donde la composición se administra una vez al día.

23. La composición según la reivindicación 14, en donde la composición se administra una vez cada dos días.

24. La composición según la reivindicación 14, en donde la composición se administra a una dosis de 1 UI a 10.000 UI.

25. La composición según la reivindicación 14, en donde la composición se administra a una dosis de 200 UI a 2500 UI.

26. La composición según la reivindicación 14, en donde la composición se administra a una dosis de aproximadamente 250 UI, aproximadamente 500 UI, aproximadamente 1000 UI o aproximadamente 2000 UI.

27. La composición según la reivindicación 14, en donde la composición se administra a una dosis tal que la 25 concentración de actividad de Factor IX circulante es 1 UI/dL a 150 UI/dL.

28. La composición según la reivindicación 14, en donde la composición se administra a una dosis tal que la concentración de actividad de Factor IX circulante es 10 UI/dL a 120 UI/dL.

29. La composición según la reivindicación 14, en donde la composición se administra a una dosis tal que la concentración de actividad de Factor IX circulante es 20 UI/dL a 100 UI/dL.